Etwas nicht

Jun 17, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1290 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bakterien und Eucarya nutzen den nichtoxidativen Pentosephosphatweg, um die Riboseeinheiten von Nukleosiden zum zentralen Kohlenstoffstoffwechsel zu leiten. Viele Archaeen verfügen nicht über diesen Weg, stattdessen nutzen Thermokokken einen Pentosebisphosphatweg, an dem Ribose-1,5-bisphosphat (R15P)-Isomerase und Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP)-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) beteiligt sind. Interessanterweise scheinen mehrere Genome halophiler Archaeen nur R15P-Isomerase zu beherbergen, nicht aber Rubisco. In dieser Studie identifizieren wir einen bisher nicht erkannten Nukleosidabbauweg in halophilen Archaeen, der aus Guanosinphosphorylase, ATP-abhängiger Ribose-1-phosphatkinase, R15P-Isomerase, RuBP-Phosphatase, Ribulose-1-phosphataldolase und Glykolaldehydreduktase besteht. Der Weg wandelt die Ribose-Einheit von Guanosin in Dihydroxyacetonphosphat und Ethylenglykol um. Obwohl der Stoffwechselweg von Guanosin zu RuBP über R15P dem des Pentosebisphosphatwegs in Thermococces ähnelt, nutzt der stromabwärts gelegene Weg Rubisco nicht und kommt nur bei halophilen Archaeen vor.

Es ist allgemein bekannt, dass Archaeen über einzigartige Stoffwechselenzyme und -wege verfügen, die in Bakterien und Eukarya nicht zu finden sind1,2,3. Ein repräsentatives Beispiel ist der Pentosestoffwechsel. Bakterien und Eukaryoten nutzen den Pentosephosphatweg4, um die Pentoseeinheiten von Nukleinsäuren zu synthetisieren oder abzubauen. Der oxidative Pentosephosphatweg (OPP-Weg) synthetisiert die Nukleinsäurevorläufer Ribulose-5-phosphat (Ru5P) und Ribose-5-phosphat (R5P) aus Glucose-6-phosphat und stellt reduzierende Äquivalente in Form von NADPH bereit. Der nichtoxidative Pentosephosphatweg (NOPP-Weg) führt die gegenseitige Umwandlung zwischen Pentosen (Ru5P und R5P) und Fructose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat durch und kann so die Riboseeinheiten von Nukleosiden in Zwischenprodukte des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels umwandeln (ergänzende Abb . 1a). Allerdings verfügen viele Archaeen nicht über die OPP- und NOPP-Signalwege. Sie nutzen stattdessen den Ribulosemonophosphat (RuMP)-Weg, um die für die Nukleinsäurebiosynthese notwendigen Pentosen zu produzieren5,6,7 und wandeln Fructose-6-phosphat in Ru5P und Formaldehyd um. Als Ausnahme besitzen die meisten halophilen Archaeen den OPP-Signalweg7,8,9,10, während eine Reihe von Archaeenarten, darunter Mitglieder von Thermoplasmatota, Thaumarchaeota, Halorhabdus, Methanococcus und Methanocaldococcus, voraussichtlich Genhomologe beherbergen, die den NOPP-Signalweg bilden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Methanocaldococcus jannaschii zwar sowohl den NOPP-Weg als auch den RuMP-Weg11 beherbergt, R5P jedoch offenbar über den RuMP-Weg12 erzeugt wird.

Für den Nukleosidabbau nutzt das hyperthermophile Archäon Thermococcus kodakarensis einen Pentosebisphosphat-Weg 13, 14, 15 (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1b). Die Metaboliten des Weges unterscheiden sich stark von denen des Pentosephosphatweges und es sind eine Reihe einzigartiger Enzyme beteiligt. Wie bei Bakterien und Eukaryoten werden Nukleoside durch drei Nukleosidphosphorylasen, die Uridin, Guanosin und Adenosin erkennen (TK1479, TK1482 bzw. TK1895), in Ribose-1-phosphate (R1P) und Nukleobasen umgewandelt. Während R1P im Pentosephosphatweg in R5P umgewandelt wird, wird R1P durch eine ADP-abhängige Ribose-1-phosphatkinase (ADP-R1PK; TK2029) in T. kodakarensis phosphoryliert, wodurch Ribose-1,5-bisphosphat (R15P) entsteht. R15P-Isomerase (TK0185) wandelt dann R15P in Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) um, das anschließend durch die Carboxylaseaktivität der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) in 3-Phosphoglycerat (3-PGA) umgewandelt wird ; TK2290)16,17,18,19. T. kodakarensis beherbergt außerdem eine einzigartige Nukleosid-5'-Monophosphat-Phosphorylase (NMP-Phosphorylase, früher als AMP-Phosphorylase bezeichnet; TK0352), die die Phosphorolyse von AMP, CMP und UMP katalysiert14,15. Dies ermöglicht die direkte Umwandlung von NMPs in R15P sowie die Umwandlung von Nukleosiden in NMPs über R1P und R15P (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1b). R15P fungiert somit als Knotenpunkt, der den Nukleosid- und Nukleotidstoffwechsel mit dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel verbindet13,20.

a Es wird angenommen, dass der in Thermococcus identifizierte klassische Pentosebisphosphat-Weg am Nukleosidabbau und/oder der Umwandlung von Nukleosiden in NMPs beteiligt ist. Der NMP-Shunt, bestehend aus NMP-Phosphorylase, R15P-Isomerase und Rubisco, baut NMPs zu 3-PGA ab. b Der in dieser Studie vorgeschlagene nicht-carboxylierende Pentosebisphosphat-Weg wird gezeigt. Rote Pfeile zeigen Reaktionen an, die spezifisch für den in dieser Studie identifizierten Stoffwechselweg sind und im klassischen Pentosebisphosphat-Stoffwechselweg fehlen. Dargestellt sind die Locus-Tags, die die Enzyme kodieren, deren rekombinante Proteine ​​in dieser Studie untersucht wurden. Locus-Tags mit Klammern sind Gene, von denen vorhergesagt wird, dass sie Enzyme kodieren, deren Aktivitäten im zellfreien Extrakt von H. salinarum nachgewiesen wurden. Bezüglich VNG_6270G wurden sowohl native als auch rekombinante Enzyme untersucht. NMP-Nukleosid-5'-monophosphat, R1P Ribose-1-phosphat, R15P Ribose-1,5-bisphosphat, RuBP Ribulose-1,5-bisphosphat, 3-PGA 3-Phosphoglycerat, Ru1P Ribulose-1-phosphat, DHAP Dihydroxyacetonphosphat .

Wenn die Verteilung des Pentosebisphosphatwegs untersucht wird, werden Homologe von NMP-Phosphorylase, R15P-Isomerase und Rubisco in einer Vielzahl von Archaeen gefunden; die meisten Vertreter von Archaeoglobales, Lokiarchaeota, Methanomicrobiales, Methanosarcinales und Thermococcales sowie einige Vertreter von Desulfurococcales, Haloicrobiales, Methanococcales und die meisten Thermofilum-Arten von Thermoproteales. Darüber hinaus wurde kürzlich berichtet, dass eine metagenomische Analyse das Vorhandensein dieser Gene in einer Reihe von Bakterienarten nahelegte21. Dies erhöht die Möglichkeit, dass dieser Teil des Pentosebisphosphatwegs, den wir hier als „NMP-Shunt“ bezeichnen, bei vielen Archaeen- und einigen Bakterienarten funktioniert. Andererseits scheint die Verbreitung von ADP-R1PK-Homologen auf Mitglieder der Thermococcus beschränkt zu sein, zu denen die Gattungen Palaeococcus, Pyrococcus und Thermococcus gehören. Es ist jedoch bekannt, dass die ADP-abhängigen Kinasen in Thermococcales Gegenstücke in anderen Archaeen haben, die auf ATP als Phosphatspender angewiesen sind. Dazu gehören die Glucokinasen22,23,24 und Phosphofructokinasen25,26 bei der Glykolyse, die Serinkinase im Aminosäurestoffwechsel27,28 und sogar die R1P-Kinase selbst13,29. Diese ATP- und ADP-abhängigen Kinasen, die denselben Phosphatakzeptor erkennen, weisen normalerweise keine Ähnlichkeit zueinander auf. Daher ist es schwierig, die Verteilung der R1P-Kinase-Aktivität ausschließlich auf der Grundlage von Genomsequenzen genau zu bestimmen. Es gibt eine große Anzahl von Proteinen in Archaeen, die als Zuckerkinasen bezeichnet werden, deren Phosphatakzeptoren nicht identifiziert wurden, und dazu könnten nicht identifizierte R1P-Kinasen gehören.

Interessanterweise fanden wir heraus, dass eine Reihe halophiler Archaeen R15P-Isomerase-Homologe aufweisen, jedoch keine Homologen für NMP-Phosphorylase und Rubisco. Darüber hinaus sind in keinem der halophilen Genome eindeutige Homologe der R1P-Kinase vorhanden. Die Genomsequenzen legen daher nahe, dass es in diesen Halophilen keine Enzyme gibt, die das Substrat liefern oder das Produkt der R15P-Isomerase nutzen würden. In dieser Studie haben wir nach Enzymen gesucht, die mit der scheinbar eigenständigen R15P-Isomerase verbunden sind, und haben einen bisher unbekannten Stoffwechselweg identifiziert, an dem die Pentosebisphosphate R15P und RuBP in halophilen Archaeen beteiligt sind.

Diese Studie wurde vor der Entdeckung des gesamten Pentosebisphosphat-Wegs begonnen, als nur ein Weg von NMPs zu 3-PGA bestehend aus NMP-Phosphorylase, R15P-Isomerase und Rubisco bekannt war14,15 (Abb. 1a). Eine Reihe von Archaeenarten enthielten Homologe aller drei Enzyme, aber interessanterweise enthielten einige halophile Archaeen nur Homologe der R15P-Isomerase15. Dazu gehört Halobacterium salinarum, das das VNG_1853G-Protein besitzt, das zu 48,1 % mit der R15P-Isomerase aus T. kodakarensis (TK0185) identisch ist, aber keine Homologen von NMP-Phosphorylase oder Rubisco enthält. Unter den 63 in Tabelle 1 aufgeführten halophilen Archaeen werden solche Fälle bei 19 Arten beobachtet (Tabelle 1, rot oder orange in Spalte VNG_1853G). Andererseits beherbergen 14 halophile Archaeen einen vollständigen Satz von Homologen (blau in den Spalten TK0352/VNG_1853G/TK2290), während 11 Arten nur R15P-Isomerase und Rubisco-Homologe besitzen (grün in den Spalten VNG_1853G/TK2290).

Wir untersuchten, ob die R15P-Isomerase-Homologen tatsächlich die Ribose-1,5-Bisphosphat-Isomerase-Reaktion katalysieren. Die entsprechenden Gene von H. salinarum (VNG_1853G) und Haloterrigena turkmenica (Htur_0571) wurden in Escherichia coli überexprimiert. Nur das Htur_0571-Protein aus H. turkmenica konnte in löslicher Form erhalten werden und wurde bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt (ergänzende Abbildung 2a). RuBP wurde aus R15P in Gegenwart des gereinigten Htur_0571-Proteins erzeugt (Abb. 2a), was darauf hinweist, dass das Protein R15P-Isomeraseaktivität aufwies und als Ht-R15P-Isomerase bezeichnet wurde. Das Ergebnis deutete auf das Vorhandensein unbekannter Wege hin, an denen R15P und RuBP in halophilen Archaeen beteiligt sind.

a In Gegenwart oder Abwesenheit des Ht-R15P-Isomerase-Enzyms wurde die Erzeugung von RuBP aus R15P untersucht. Schwarze, rosa, blaue und grüne Linien zeigen das Reaktionsprodukt ohne Enzym, das mit Enzym, 20 mM R15P-Standardverbindung bzw. 10 mM RuBP-Standardverbindung. b In Gegenwart oder Abwesenheit des Hx-RbsK-Proteins wurde die Erzeugung von R15P aus R1P untersucht. Schwarze, rosa, blaue und grüne Linien zeigen das Reaktionsprodukt ohne Enzym, das mit Enzym, 10 mM R1P-Standardverbindung bzw. 20 mM R15P-Standardverbindung. c Die Umwandlung von R1P mit den Isomeraseproteinen Hx-RbsK und Ht-R15P wurde untersucht. Nach der Kinasereaktion durch Hx-RbsK wurde die Isomerasereaktion durch Ht-R15P-Isomerase durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels HPLC analysiert. Rosa und schwarze Linien zeigen Reaktionsprodukte mit bzw. ohne Ht-R15P-Isomerase in der zweiten Reaktion. Mit einer Säule getrennte Verbindungen wurden mit einem Differentialbrechungsindexdetektor überwacht.

Um Enzyme zu identifizieren, die am Metabolismus von R15P oder RuBP beteiligt sind, wurden Kandidatengene anhand der Genomsequenzen durchsucht. Zu den halophilen Archaeen mit dem eigenständigen R15P-Isomerase-Homolog gehören H. salinarum30, Halopiger xanaduensis31, Halorubrum lacusprofundi32, H. turkmenica33, halophile Archaeen DL31, Natrinema pellirubrum, Natronobacterium gregoryi und Natronococcus occultus. Wir suchten nach Genen, die in diesen acht Arten ein Operon mit dem R15P-Isomerase-Homolog bilden, und stellten fest, dass Gene, die als „Zuckerkinase, Ribokinase“/„PfkB-Domänenprotein“ (rbsK) bezeichnet waren, in allen acht Fällen Operons mit den R15P-Isomerase-Homologen bildeten „Uridinphosphorylase“-Gene (Urdpase) bildeten in sechs Fällen Operons (Abb. 3). Von den 19 Genomen, die ein R15P-Isomerase-Homolog, aber kein Rubisco- und NMP-Phosphorylase-Homolog enthalten, besitzen alle mit Ausnahme von Halorhabdus tiamatea sowohl rbsK- als auch urdpase-Homologe (Tabelle 1, Spalten VNG_1851G/VNG_1850G). Dies deutete darauf hin, dass die beiden Genprodukte metabolisch mit der R15P-Isomerase verknüpft sind.

Farbcodes relevanter Gene sind in der Abbildung angegeben. Weiße und graue Kästchen mit Pfeilen sind Gene, die höchstwahrscheinlich Operons mit den fokussierten fünf Genen bilden. In den grauen Kästchen mit Pfeilen spiegelt sich die Genlänge nicht in der Breite jedes Kästchens mit Pfeilen wider. Schwarze Pfeile zeigen vorhergesagte Operons an.

Rekombinante RbsK-Proteine ​​aus H. salinarum, H. turkmenica und H. xanaduensis (Hs-RbsK, Ht-RbsK und Hx-RbsK, kodiert durch VNG_1851G, Htur_0569 bzw. Halxa_1682) wurden in E. coli produziert. Hs-RbsK bildete Einschlusskörperchen und die Expressionsniveaus des Ht-RbsK-Gens waren niedrig. Es wurden ausreichende Mengen an löslichem Hx-RbsK-Protein erhalten und teilweise gereinigt (ergänzende Abbildung 3a). Die Kinaseaktivitäten des teilweise gereinigten Hx-RbsK-Proteins wurden gegenüber verschiedenen Phosphatakzeptorsubstraten getestet (Ergänzungstabelle 1), wobei ATP oder eine Mischung aus Nukleosidtriphosphaten (NTPs) als Phosphatdonor verwendet wurde (Ergänzungstabelle 4). Wir untersuchten 85 Substrate, darunter Nukleoside, Aldosen, Aminozucker, Alkohole, Ketosen, Nukleotide, Zuckerphosphate, Disaccharide, Zuckeralkohole und Desoxyzucker. Bei Normalisierung durch Reaktionszeit und Enzymmenge war die Produktion von Nukleosid-5'-diphosphat (NDP) bei Ribose-1-phosphat (R1P) am höchsten (468 nmol ADP min−1 mg−1). Wir verzichten darauf, die Werte dieser Messungen als Reaktionsgeschwindigkeiten zu bezeichnen, da die Produktbildungsgeschwindigkeit nicht unbedingt über den gesamten Reaktionszeitraum konstant ist. Der nächsthöhere Wert wurde mit Xylulose (62 nmol NDP min−1 mg−1) beobachtet, gefolgt von 2'-Desoxyguanosin (57 nmol NDP min−1 mg−1) und D-Ribulose (49 nmol NDP min−1 mg−). 1). Das rekombinante Hx-RbsK-Protein wurde für weitere biochemische Analysen gereinigt (ergänzende Abbildung 2b). Unter Verwendung von R1P als Phosphatakzeptor bevorzugte das Enzym ATP unter den NTPs (ergänzende Abbildung 5a). Die HPLC-Analyse des Hx-RbsK-Reaktionsprodukts zeigte, dass R15P aus R1P erzeugt wurde (Abb. 2b). Darüber hinaus wurde das Hx-RbsK-Produkt R15P durch Ht-R15P-Isomerase zu RuBP isomerisiert (Abb. 2c). Hx-RbsK benötigte Salz für seine Kinaseaktivität und 2,0 M war die optimale KCl-Konzentration (ergänzende Abbildung 5b). In Gegenwart von 4 mM ATP und 20 mM R1P beobachteten wir eine spezifische Aktivität von 30,1 μmol min−1 mg−1. Die Analysen des Halxa_1682-Proteins zeigten, dass das Protein Hx-RbsK eine ATP-abhängige Ribose-1-Phosphat-Kinase (ATP-R1PK) ist, die das Substrat für die R15P-Isomerase erzeugt.

Fast alle Genome halophiler Archaeen enthalten zwei Proteine, die als Uridinphosphorylase bezeichnet werden (Tabelle 1, Spalten VNG_1850G/VNG_0893G). VNG_1850G-Homologe bilden bei einigen Arten ein Operon mit den Genen R15P-Isomerase und ATP-R1PK, während die Positionen von VNG_0893G-Homologen nicht mit dem Operon zusammenhängen. Ersteres wird hier als Urdpase1 und letzteres als Urdpase2 bezeichnet. Sie können phylogenetisch unterschieden werden (ergänzende Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass ihre Funktionen und/oder enzymatischen Eigenschaften unterschiedlich sind. In dieser Studie wurde das Urdpase1-Protein untersucht. Obwohl wir davon ausgegangen sind, dass Urdpase1 eine Nukleosidphosphorylasereaktion katalysiert und R1P, das Substrat für ATP-R1PK, erzeugt, war unklar, welche Nukleoside vom Enzym erkannt werden.

Es wurden vier rekombinante Urdpase1-Proteine ​​aus H. salinarum, H. xanaduensis, H. lacusprofundi und H. turkmenica (Hs-, Hx-, Hl- und Ht-Urdpase1, kodiert durch VNG_1850G, Halxa_1684, Hlac_2318 bzw. Htur_0567) hergestellt unter Verwendung von E. coli. Hl-Urdpase1 und Ht-Urdpase1 wurden als lösliche Proteine ​​erhalten, während die anderen beiden Einschlusskörper bildeten. Das rekombinante Hl-Urdpase1-Protein wurde bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt (ergänzende Abbildung 2c). Die Nukleosidphosphorylaseaktivität von gereinigtem Hl-Urdpase1 wurde gegenüber sechs Nukleosiden untersucht: Adenosin, Inosin, Guanosin, Cytidin, Uridin und Thymidin (Abb. 4a und ergänzende Abb. 7). Hl-Urdpase1 zeigte die höchste Aktivität gegenüber Guanosin und konnte Adenosin und Inosin in geringerem Maße erkennen. Überraschenderweise war die Aktivität bei höheren KCl-Konzentrationen geringer (ergänzende Abbildung 8a). Das Enzym behielt jedoch auch bei 2–4 M KCl eine beträchtliche Guanosinphosphorylase-Aktivität. Die optimale Reaktionstemperatur und der optimale pH-Wert des Enzyms betrugen 30 ° C bzw. 7, 5 (ergänzende Abbildung 8b, c). Kinetische Analysen gegenüber Guanosin und Phosphat ergaben, dass die kinetischen Parameter Vmax und Km 1,5 ± 0,1 μmol min–1 mg–1 und 56 ± 10 μM gegenüber Guanosin (ergänzende Abbildung 9a) und 2,1 ± 0,1 μmol min–1 mg–1 betrugen 4,8 ± 0,8 mM gegenüber Phosphat (ergänzende Abbildung 9b). Die Ergebnisse legen nahe, dass Hlac_2318 eine Guanosinphosphorylase kodiert. Die Identifizierung von Guanosinphosphorylase, ATP-R1PK und R15P-Isomerase implizierte das Vorhandensein eines Stoffwechselwegs, der Guanosin, Phosphat und ATP über R1P und R15P in RuBP, Guanin und ADP umwandelt (Abb. 1b). Obwohl ATP der Phosphatdonor der R1P-Kinase ist, entspricht der Stoffwechselweg von Guanosin zu RuBP dem in Thermococcus13 identifizierten Pentosebisphosphatweg.

Die Nukleosidphosphorylaseaktivität von Hl-Urdpase1 wurde gegenüber sechs Nukleosiden durch Quantifizierung der freigesetzten Nukleobasen mit HPLC analysiert. b Die Phosphataseaktivität der Hx-HAD-Hydrolase wurde gegenüber elf Zuckerphosphaten und pNPP durch Quantifizierung des freigesetzten Phosphats mit Malachitgrün untersucht. G1P Glucose-1-phosphat, G6P Glucose-6-phosphat, G16P Glucose-1,6-bisphosphat, F1P Fructose-1-phosphat, F6P Fructose-6-phosphat, F16P Fructose-1,6-bisphosphat, R5P Ribose-5 -Phosphat, Ru5P Ribulose-5-phosphat, pNPP p-Nitrophenylphosphat. c Die Aldolaseaktivität des Hx-FucA-kondensierenden DHAP und sechs Aldehyden wurde durch Quantifizierung des restlichen DHAP nach Reaktionen mit einem Kopplungsenzym untersucht. Die Aktivitäten wurden aus n = 3 unabhängigen Experimenten berechnet. Fehlerbalken geben Standardabweichungen an.

Neben der R15P-Isomerase ist Rubisco das einzige Enzym, von dem bekannt ist, dass es RuBP als Substrat nutzt. Das Vorhandensein eines Stoffwechselwegs, der RuBP in halophilen Archaeen ohne Rubisco erzeugt, deutete auf das Vorhandensein nicht identifizierter Enzyme hin, die an der Umwandlung von RuBP beteiligt sind. Wir haben einen vergleichenden genomischen Ansatz zusammen mit einer phylogenetischen Analyse gewählt, um Enzyme zu identifizieren, die an diesem Stoffwechsel beteiligt sein könnten. Wir fanden heraus, dass ein als Fuculose-1-Phosphat-Aldolase (fucA) bezeichnetes Gen spezifisch in 17 der 19 halophilen Archaeen vorhanden ist, die eine eigenständige R15P-Isomerase beherbergen. FucA-Homologe sind unter den halophilen Archaeen weit verbreitet und ein Zusammenhang mit dem Vorkommen der R15P-Isomerase ist nicht ohne weiteres erkennbar. Eine phylogenetische Analyse (ergänzende Abbildung 10) zeigt jedoch eine Gruppe von FucA-Homologen, die gleichzeitig mit eigenständigen R15P-Isomerasen auftreten (Tabelle 1, VNG_1201G [siebte Spalte], bezeichnet als FucA) und von den anderen unterschieden werden kann (Tabelle 1, VNG_1201G [elfte Spalte], bezeichnet als FucA*). Es gab nur zwei Organismen (H. tiamatea und Halohasta litchfieldiae), die eine eigenständige R15P-Isomerase, aber kein FucA enthielten. Andererseits fanden wir heraus, dass ein anderes Gen, das als Halosäure-Dehalogenase (HAD)-Superfamilie-Hydrolase (HAD-Hydrolase, Hadhlase) bezeichnet wird, auch spezifisch in den 17 Halophilen vorhanden ist (Tabelle 1, Spalte VNG_1202C). Darüber hinaus bilden diese beiden Gene in allen 17 halophilen Archaeen ein Operon (Abb. 3). Darüber hinaus sind in H. lacusprofundi, Halorubrum sp. PV6 und Halorubrum ezzemoulense, die vier Gene, die für ATP-R1PK, R15P-Isomerase, HAD-Hydrolase und FucA kodieren, bilden ein Operon. Die beiden Gene fucA und Hadhlase weisen ein starkes gemeinsames Vorkommen mit den drei Genen auf, die für Guanosinphosphorylase, ATP-R1PK und R15P-Isomerase kodieren, was die Möglichkeit einer metabolischen Verwandtschaft dieser fünf Proteine ​​stark erhöht.

Wir untersuchten die Möglichkeit, dass die als HAD-Hydrolase und FucA bezeichneten Proteine ​​am RuBP-Metabolismus beteiligt sind. Es ist bekannt, dass die Hydrolase der HAD-Superfamilie aus Arabidopsis thaliana die Phosphatasereaktion von Ribose-5-phosphat (R5P) zu Ribose katalysiert (ergänzende Abbildung 11a) . Basierend auf der strukturellen Ähnlichkeit zwischen R5P und RuBP (ergänzende Abbildung 11a, b) stellten wir die Hypothese auf, dass das Enzym eine RuBP-Phosphatasereaktion katalysiert. Das für HAD-Hydrolase aus H. xanaduensis (Halxa_2271) kodierende Gen wurde in E. coli überexprimiert und das rekombinante Protein (Hx-HAD-Hydrolase) wurde bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt (ergänzende Abbildung 2d). Die Phosphataseaktivität wurde gegenüber 12 Zuckerphosphaten gemessen. Wir beobachteten nur dann eine nennenswerte Phosphatproduktion, wenn RuBP als Substrat verwendet wurde (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass es sich bei dem Enzym um eine Phosphatase mit strenger Substratspezifität gegenüber RuBP handelte. Die optimale KCl-Konzentration lag über 2,5 M (ergänzende Abbildung 12a), während der optimale pH-Wert der Reaktion ~6 betrug (ergänzende Abbildung 12b). Die Kationenspezifität des Enzyms war breit, wobei in Gegenwart von 1 mM Mg2+, Mn2+, Co2+ und Ni2+ ähnliche Aktivitätsniveaus festgestellt wurden (ergänzende Abbildung 12c). Die kinetische Analyse gegenüber RuBP (ergänzende Abbildung 13) ergab, dass Vmax und Km gegenüber RuBP 31 ± 2 µmol min−1 mg−1 bzw. 2,2 ± 0,5 mM betrugen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Enzym, das als HAD-Hydrolase (kodiert durch Halxa_2271) bezeichnet wurde, ein Enzym ist, das eine bisher unbekannte biologische Reaktion katalysiert, die Dephosphorylierung von RuBP. Wir bezeichnen das Enzym als RuBP-Phosphatase.

Die Dephosphorylierung von RuBP kann zur Bildung von drei Reaktionsprodukten führen: Ribulose-1-phosphat (Ru1P), Ribulose-5-phosphat (Ru5P) und Ribulose. Wir führten daher eine 1H-NMR-Analyse des Reaktionsprodukts durch (Ergänzende Abbildung 14). Obwohl auch von RuBP abgeleitete chemische Verschiebungen nachgewiesen wurden, wurden die in einem früheren Bericht gezeigten chemischen Verschiebungen, die für ein zyklisiertes Ru1P spezifisch sind, im Reaktionsprodukt bestätigt (ergänzende Abbildung 14b, c). Dies legt nahe, dass RuBP-Phosphatase die Hydrolyse der Phosphatgruppe an der C5-Position von RuBP katalysiert und Ru1P erzeugt (Abb. 1b).

Klassisches FucA ist ein Enzym, das die Aldolasereaktion von Fuculose-1-phosphat (Fu1P) katalysiert. Fu1P wird in Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und l-Lactaldehyd gespalten (ergänzende Abbildung 11c). Wir haben festgestellt, dass die chemischen Strukturen von Ru1P und Fu1P ähnlich sind und der Unterschied nur in der C6-Methylgruppe liegt (ergänzende Abbildung 11b, c). Darüber hinaus haben wir zur Kenntnis genommen, dass die Fuculose-1-Phosphat-Aldolase aus E. coli, die 33,8 % Identität zu FucA aufweist, zwar nur 10 % der Aktivität gegenüber den physiologischen Substraten DHAP und l-Lactaldehyd aufweist H. xanaduensis (Hx-FucA) konnte DHAP und Glykolaldehyd erkennen36. Rekombinantes Hx-FucA wurde daher unter Verwendung von E. coli hergestellt und bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt (ergänzende Abbildung 2e). Da Ru1P nicht im Handel erhältlich ist, haben wir durch Quantifizierung des restlichen DHAP untersucht, ob Hx-FucA die Aldolasereaktion katalysieren kann, bei der DHAP und Aldehyde kondensiert werden. Die getesteten Aldehyde waren Acetaldehyd, Propionaldehyd, Isobutylaldehyd, DL-Glycerinaldehyd, DL-Lactaldehyd und Glykolaldehyd (ergänzende Abbildung 15). Das Protein zeigte Aldolaseaktivität gegenüber DHAP und allen getesteten Aldehyden (Abb. 4c). Das Ergebnis deutete darauf hin, dass das Enzym trotz seiner breiten Substratspezifität die Aldolasereaktion katalysieren konnte, bei der Ru1P in DHAP und Glykolaldehyd gespalten wird. Mit HPLC haben wir außerdem bestätigt, dass das Reaktionsprodukt der Hx-FucA-Reaktion mit DHAP und Glykolaldehyd eine Elutionszeit aufwies, die mit der des RuBP-Phosphatase-Reaktionsprodukts identisch war (ergänzende Abbildung 16a). Bei der Zugabe von ZnCl2 zum Reaktionsgemisch wurde ein Anstieg der Aktivität beobachtet, während bei der Zugabe von EDTA eine Abnahme beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass das Enzym von Zinkkationen abhängig war (ergänzende Abbildung 17). Darüber hinaus untersuchten wir, ob Hx-RuBP-Phosphatase und das Hx-FucA-Protein zusammen DHAP aus RuBP erzeugen können. Erst wenn beide Proteine ​​im Reaktionsgemisch vorhanden waren, wurde DHAP aus RuBP hergestellt (ergänzende Abbildung 16b). Darüber hinaus ergaben kinetische Analysen des Enzyms, dass Vmax und Km gegenüber Glykolaldehyd 2,0 ± 0,0 µmol min−1 mg−1 bzw. 3,4 ± 0,3 mM betrugen (ergänzende Abbildung 18a) und jene gegenüber DHAP 2,0 ± 0,0 µmol min− betrugen 1 mg−1 bzw. 3,5 ± 0,3 mM (Ergänzende Abbildung 18b). Basierend auf diesen Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass das als FucA annotierte und von Halxa_2272 kodierte Protein eine Ru1P-Aldolase ist, die DHAP und verschiedene Aldehyde, einschließlich Glykolaldehyd, erkennt.

Basierend auf den hier erzielten Ergebnissen schlagen wir vor, dass die eigenständige R15P-Isomerase ein Bestandteil eines bisher nicht identifizierten Nukleosid-Stoffwechselwegs ist, der die Riboseeinheit von Guanosin in Glykolaldehyd und DHAP umwandelt (Abb. 1b). Da Rubisco an diesem Weg nicht beteiligt ist, bezeichnen wir ihn hier als nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphat-Weg.

Obwohl DHAP durch den zentralen Zuckerstoffwechsel verstoffwechselt werden kann, war das Schicksal von Glykolaldehyd noch unklar. Allerdings konnten wir anhand der Genominformationen kein Kandidatenenzym identifizieren, das Glykolaldehyd metabolisieren würde. Durch die Messung der Enzymaktivität im zellfreien H. salinarum-Extrakt, die möglicherweise Glykolaldehyd umwandeln könnte, konnten wir eine reduzierende Aktivität auf Glykolaldehyd unter Verwendung von NADH als Elektronendonor nachweisen.

Aus dem mit Nukleosiden kultivierten zellfreien Extrakt von H. salinarum reinigten wir das Protein, das Glykolaldehydreduktaseaktivität zeigte, bis zur scheinbaren Homogenität (ergänzende Abbildung 2f). Durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Analyse wurde gezeigt, dass das gereinigte Protein das Produkt des VNG_6270G-Gens ist, das als sn-Glycerol-1-Phosphat-Dehydrogenase bezeichnet wird. Die enzymatische Analyse ergab, dass die optimale KCl-Konzentration höher als 4 M war und die optimale Reaktionstemperatur und der optimale pH-Wert 40 °C bzw. ~6 betrugen (ergänzende Abbildung 19). Die kinetische Analyse gegenüber Glykolaldehyd (ergänzende Abbildung 20a) zeigte, dass das Enzym einer Substrathemmung unterlag. Die Vmax-, Ks1- und Ks2-Werte betrugen 33 ± 4 μmol min−1 mg−1, 10 ± 2 mM bzw. 35 ± 8 mM. Unter Berücksichtigung der ursprünglichen Anmerkung haben wir weiter untersucht, ob das Protein die Sn-Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase-Reaktion katalysiert oder nicht (ergänzende Abbildung 20b). Das gereinigte Enzym zeigte keine nennenswerte Aktivität bei der Oxidation von Glycerin-1-phosphat oder der Reduktion von DHAP. Darüber hinaus wurde das rekombinante VNG_6270G-Protein unter Verwendung von E. coli hergestellt und teilweise gereinigt (ergänzende Abbildung 3b). Wie erwartet zeigte das rekombinante Protein (Hs-GaR) ein hohes Maß an Glykolaldehydreduktase-Aktivität (40,7 ± 0,4 μmol min−1 mg−1).

Da angenommen wird, dass Sn-Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase durch die Reduktion von DHAP zu Glycerin-1-Phosphat zur Biosynthese von Lipidvorläufern der archaealen Membran beiträgt, scheint das Enzym in allen Archaeen essentiell zu sein. Wir fanden jedoch ein anderes Gen, das als sn-Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase bezeichnet wird und in allen halophilen Archaeen, einschließlich H. salinarum (VNG_0406C), verbreitet ist (Tabelle 1, Spalte VNG_0406C). Die charakterisierte archaeale Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase aus Methanothermobacter thermautotrophicus37,38,39 weist eine höhere Ähnlichkeit mit dem VNG_0406C-Protein (50,7 % identisch) als mit dem VNG_6270G-Protein (22,5 % identisch) auf. Dies legt nahe, dass das VNG_6270G-Gen für Glykolaldehydreduktase und nicht für Sn-Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase kodiert (Abb. 1b) und dass das Gen, das für die echte Sn-Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, höchstwahrscheinlich VNG_0406C ist.

Was die Verteilung der VNG_6270G-Genhomologe (Tabelle 1, Spalte VNG_6270G) betrifft, so ist ihre Verteilung auf nur zehn halophile Archaeen beschränkt und das Homolog in H. salinarum ist auf einem Plasmid kodiert. Obwohl die Hälfte über einen vollständigen Satz von Genen verfügt, die den nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphat-Weg bilden, ist dies bei der anderen Hälfte nicht der Fall. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen konnten, dass es Plasmide gibt, deren Sequenzen in den Genomanalysen übersehen wurden, könnte der Beitrag von VNG_6270G-Homologen zum Nukleosidabbau in halophilen Archaeen begrenzt sein und es könnten andere Wege für den Glykolaldehyd-Metabolismus existieren.

An den oben beschriebenen biochemischen Analysen sind Enzyme verschiedener Arten halophiler Archaeen beteiligt. Um zu bestätigen, dass der vorgeschlagene Weg in einer einzelnen Art vorhanden ist, haben wir die Enzymaktivitäten im zellfreien Extrakt von H. salinarum untersucht. Bei Zugabe jedes Substrats zum Reaktionsgemisch, einschließlich zellfreier Extrakte, wurden die Produkte der Reaktionen Guanosinphosphorylase (R1P), ATP-abhängige R1P-Kinase (R15P), RuBP-Phosphatase (Ru1P) und Glykolaldehydreduktase (Ethylenglykol) nachgewiesen ( Ergänzende Abb. 21a, b, d, f). Andererseits konnten wir bei Zugabe von R15P zum Reaktionsgemisch RuBP, das Produkt der R15P-Isomerase, nicht nachweisen. Anstelle von RuBP konnten wir jedoch die Bildung von Ru1P beobachten (ergänzende Abbildung 21c). Dieses Ergebnis impliziert, dass das aus R15P durch R15P-Isomerase erzeugte RuBP anschließend durch RuBP-Phosphatase in Ru1P umgewandelt wurde. Um die Aktivität der Ru1P-Aldolase zu bestätigen, wurde eine durch RuBP-Phosphatase und Ru1P-Aldolase katalysierte Kopplungsreaktion untersucht, da Ru1P nicht im Handel erhältlich ist. Infolgedessen wurde DHAP, das vermutlich durch Ru1P-Aldolase aus Ru1P produziert wird, bei Zugabe von RuBP und ZnCl2 eindeutig nachgewiesen (ergänzende Abbildung 21e). Die vorhergesagten Aktivitäten der von den sechs Genen kodierten Enzyme waren in H. salinarum nachweisbar, was auf das Vorhandensein des nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphat-Weges in diesem Organismus schließen lässt.

Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie schlagen wir einen bisher nicht erkannten Nukleosidabbauweg, den nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphatweg, in halophilen Archaeen vor (Abb. 1b). Obwohl der Metabolismus von Guanosin zu RuBP über R15P dem im Pentosebisphosphat-Weg in Thermococces ähnelt, ist der Downstream-Weg einzigartig. Wir können davon ausgehen, dass die physiologische Rolle des Stoffwechselwegs darin besteht, die Riboseeinheit von Nukleosiden in DHAP und Ethylenglykol umzuwandeln. DHAP kann in verschiedenen Stoffwechselvorgängen verwendet werden, einschließlich der Oxidation zu Pyruvat über Glycerinaldehyd-3-phosphat, der Gluconeogenese und der Umwandlung in Glycerin zur Verwendung in der Membranlipidbiosynthese und der Osmolytproduktion. Andererseits ist das metabolische Schicksal von Ethylenglykol noch unklar und weitere Untersuchungen werden notwendig sein, um zu verstehen, ob und wie die Zellen die beiden aus Pentosen stammenden Kohlenstoffe nutzen.

Unsere Ergebnisse und die Verteilung der Genhomologen legen das Vorhandensein mehrerer Variationen von Nukleosidabbauwegen in halophilen Archaeen nahe, an denen alle die Pentosebisphosphate R15P und RuBP beteiligt sind. Ein gemeinsames Merkmal der in halophilen Archaeen gefundenen Nukleosidabbauwege ist, dass das in Thermococcales gefundene ADP-R1PK durch das in dieser Studie identifizierte ATP-R1PK ersetzt wird (Abb. 1 und 5). Wie in Tabelle 1 gezeigt, tragen von den 63 Arten halophiler Archaeen, deren Genomsequenzen bestimmt wurden, 44 Arten R15P-Isomerase-Homologe in ihren Genomen, was auf das Vorhandensein eines Metabolismus unter Beteiligung der Pentosebisphosphate R15P und RuBP in diesen Organismen schließen lässt. Unter diesen scheinen 25 Arten Rubisco für den RuBP-Metabolismus zu nutzen. Der in dieser Studie identifizierte nicht-carboxylierende Pentosebisphosphat-Weg unter Verwendung von RuBP-Phosphatase und Ru1P-Aldolase kommt in 17 halophilen Arten vor und ist ebenfalls weit verbreitet. Die verbleibenden zwei Arten mit einer R15P-Isomerase enthalten weder Rubisco noch RuBP-Phosphatase/Ru1P-Aldolase. Homologe der NMP-Phosphorylase kommen nur in Arten mit einem Rubisco vor. Von den 25 Arten mit Rubisco weisen 14 ein NMP-Phosphorylase-Homolog auf, 11 dagegen nicht. Es scheint daher, dass es drei Hauptvarianten des Pentosebisphosphat-Wegs in Halophilen gibt, die 42 der 63 in Tabelle 1 aufgeführten Arten ausmachen; (i) eine mit Rubisco und NMP-Phosphorylase, wie bei Mitgliedern von Thermococcales (Abb. 5a), (ii) eine mit Rubisco, aber ohne NMP-Phosphorylase (Abb. 5b) und (iii) der identifizierte nicht-carboxylierende Pentosebisphosphat-Weg in dieser Studie (Abb. 1b und 5c). Die Verteilung dieser Variationen unter den halophilen Archaeen hängt nicht mit den phylogenetischen Beziehungen ihrer Ursprungsorganismen zusammen (Abb. 6). Interessanterweise gibt es immer noch 10 Arten, die eine Reihe von Homologen enthalten, die der Nukleosidphosphorylase und ATP-R1PK entsprechen (Tabelle 1, gelb in den Spalten VNG_1851G/VNG_1850G), die die Riboseeinheiten von Nukleosiden in R15P umwandeln würden. Dies erhöht die Möglichkeit, dass es in halophilen Archaeen noch mehr Variationen der Nukleosidabbauwege gibt, an denen Pentosebisphosphate beteiligt sind.

Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse und die Verteilung relevanter Gene deuten auf das Auftreten von drei Arten von Nukleosidabbauwegen in halophilen Archaeen hin. Die drei Stoffwechselwege verlaufen mit NMP-Phosphorylase und Rubisco (a), mit Rubisco, aber ohne NMP-Phosphorylase (b), ohne Rubisco oder NMP-Phosphorylase, aber mit RuBP-Phosphatase und Ru1P-Aldolase (c).

Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung von 16S-rRNA-Gensequenzen erstellt. Als Fremdgruppe wurde eine Sequenz aus Thermoplasma volcanium (tvo) verwendet. Die Farben der Kreise entsprechen denen der Nukleosid-Stoffwechselwege in Abb. 5. Die in roten und rosa Codes dargestellten Organismen weisen auf die in Abb. 3 gezeigten halophilen Archaeen hin. Die Organismen in roten Codes zeigen diejenigen, deren Proteine ​​tatsächlich in dieser Studie untersucht wurden .

Wie oben angegeben, gibt es 21 halophile Arten, deren Genomsequenzen auf das Fehlen der carboxylierenden/nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphat-Wege schließen lassen. Unter ihnen enthalten Halorhabdus utahensis und Halorhabdus tiamatea Homologe des klassischen NOPP-Signalwegs, der in Bakterien und Eukaryoten vorkommt, und der NOPP-Signalweg könnte für den Nukleosidabbau bei diesen Arten verantwortlich sein. Allerdings gibt es immer noch 19 halophile Archaeen, deren Genomsequenzen keine Hinweise darauf geben, wie sie den Nukleosidabbau durchführen. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass diese Spezies keine Nukleoside verwenden, sind wir auf ein FucA*-Homolog aufmerksam geworden, das sich von dem unterscheidet, das in dieser Studie als Ru1P-Aldolase identifiziert wurde (Tabelle 1, letzte Spalte). Das Homolog kommt tendenziell in diesen Halophilen vor, darunter neun Arten in Haloarcula, Haloplanus und Halohasta, und könnte Hinweise zur Identifizierung zusätzlicher Wege liefern, die am Nukleosid- oder Pentosestoffwechsel beteiligt sind.

Die Analyse rekombinanter Hl-Urdpase1 zeigte, dass das Enzym Guanosin als Nukleosidsubstrat für die Phosphorylasereaktion bevorzugte. Interessanterweise weist das Enzym (Hlac_2318) in T. kodakarensis eine höhere Ähnlichkeit mit der Uridinphosphorylase (TK1479) (40,2 % identisch) als mit der Guanosinphosphorylase (TK1482) (18,7 % identisch) auf. Zusätzlich zur Guanosinphosphorylase beherbergen fast alle halophilen Archaeen ein zweites Uridinphosphorylase-Homolog, Urdpase2. Obwohl diese zweiten Homologen kein Operon mit Genen des Pentosebisphosphat-Weges bilden, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Genprodukte auch R1P über Nukleosidphosphorolyse erzeugen. Die phylogenetische Analyse ergab eindeutig, dass Urdpase1 und Urdpase2 unterschiedlich sind (ergänzende Abbildung 6), was darauf hindeutet, dass sich die enzymatischen Eigenschaften der Mitglieder der beiden Untergruppen voneinander unterscheiden. Die Identifizierung des Nukleosidsubstrats von Urdpase2 wird zu unserem Verständnis des Nukleosidabbaus in halophilen Archaeen beitragen. Es ist faszinierend, dass nur eines der beiden Nukleosidphosphorylase-Gene, das Guanosinphosphorylase-Gen, ein Operon mit den Genen des nicht-carboxylierenden Pentosebisphosphat-Wegs bildet. Dies könnte mit den hohen GC-Gehalten im Genom halophiler Archaeen wie H. salinarum (67,9 %) zusammenhängen30. Nukleoside/Nukleotide mit Guanin und Cytosin könnten in diesen Zellen in einer höheren Konzentration gehalten werden.

In früheren Studien wurden zwei R1P-Kinasen identifiziert; eine ADP-abhängige R1P-Kinase aus dem hyperthermophilen Archaeon T. kodakarensis (TK2029) und eine ATP-abhängige R1P-Kinase aus dem hyperthermophilen Archaeon Pyrobaculum calidifontis (Pcal_0041). Die in dieser Studie identifizierte ATP-abhängige R1P-Kinase (Halxa_1682) war zu 25 % mit dem TK2029-Protein und zu 36,8 % mit dem Pcal_0041-Protein identisch. Beim Vergleich der Eigenschaften der drei Enzyme ist die R1P-Kinase aus T. kodakarensis ADP-abhängig, während die Enzyme aus P. calidifontis und H. xanaduensis/H. salinarum sind ATP-abhängig. Andererseits zeigen die Enzyme von T. kodakarensis und H. xanaduensis eine strenge Substratspezifität gegenüber R1P, während die R1P-Kinase von P. calidifontis zusätzlich zu R1P29 auch Cytidin und Uridin erkennen kann. In P. calidifontis sind weder R15P-Isomerase- noch NMP-Phosphorylase-Genhomologe vorhanden, was dem oben beschriebenen Fall der zehn halophilen Archaeen mit nur Nukleosidphosphorylase- und ATP-R1PK-Homologen ähnelt. Andererseits wurde das Vorhandensein der R1P-Kinase in E. coli vermutet40. Eine Untersuchung von Enzymen/Genen, die eine Deletion im 5-Phospho-D-ribosyl-1-diphosphat (PRPP)-Synthase-Gen unterdrücken können, führte zu einem vorgeschlagenen Weg mit der Reaktionssequenz R5P → R1P → R15P → PRPP. Es wurde ein von phnN kodiertes Protein identifiziert, das Kinaseaktivität gegenüber R15P zeigt, was zur Produktion von PRPP führt. Ein Protein, das für die vorgeschlagene zweite Reaktion verantwortlich ist, wäre, obwohl nicht identifiziert, eine R1P-Kinase. E. coli besitzt mehrere Enzyme, die Ähnlichkeit mit den Archaeenproteinen aufweisen, die R1P-Kinaseaktivität aufweisen. Da es sich hierbei um Proteine ​​handelt, deren Funktion noch nicht geklärt ist, könnte es sich bei einem dieser Proteine ​​auch um die R1P-Kinase handeln. Die R1P-Kinase und ihr Produkt R15P könnten über Archaeen und Bakterien weiter verbreitet werden als bisher erwartet.

Sofern nicht anders angegeben, wurden chemische Reagenzien von Nacalai Tesque (Kyoto, Japan), FUJIFILM Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan) oder Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Das halophile Archäon Halobacterium salinarum und seine genomische DNA wurden vom RIKEN BioResource Research Center über das National BioResource Project von MEXT/AMED, Japan, bereitgestellt. H. salinarum wurde bei 40 °C in einem Medium kultiviert, das 250 g l-1 Natriumchlorid, 20 g l-1 MgSO4 · 7H2O, 3 g l-1 Trinatriumcitrat, 2 g l-1 Kaliumchlorid, 5 g l-1 Trypton und 3 g l-1 Trypton enthielt g l−1 Hefeextrakt (in dieser Studie als Medium mit hohem Salzgehalt definiert). Bei Bedarf wurden dem Medium Nukleoside zugesetzt. Der für die Plasmidkonstruktion verwendete Escherichia coli DH5α-Stamm und die für die Genexpression verwendeten E. coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIL- und Rosetta (DE3)-Stämme wurden bei 37 °C in Lysogenie-Brühe (LB)-Medium mit Ampicillin (100 mg l−1) kultiviert ).

Plasmide zur Expression von Genen, die für Hs-R15P-Isomerase und Hs-Urdpase1 kodieren, wurden wie folgt konstruiert. Kodierende Regionen der Hs-R15P-Isomerase- und Hs-Urdpase1-Gene wurden durch PCR unter Verwendung genomischer DNA von H. salinarum als Matrize und expHs-R15Pi-F/-R bzw. Hs-Urdpase1-F/-R als Primersätze amplifiziert. Die Primer wurden so konzipiert, dass NdeI- und BamHI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'-Termini der amplifizierten DNA-Fragmente eingeführt wurden. Die Sequenzen dieser Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Nach dem Verdau mit NdeI und BamHI wurden die DNA-Fragmente einzeln mit pET-21a(+) ligiert, das mit denselben Restriktionsenzymen verdaut wurde. Die resultierenden Expressionsplasmide werden als pET-Hs-R15P-Isomerase und pET-Hs-Urdpase1 bezeichnet (Ergänzungstabelle 2).

Expressionsplasmide für Gene, die für Ht-R15P-Isomerase, Hs-RbsK, Ht-RbsK, Hx-RbsK, Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD-Hydrolase, Hx-FucA und Hs-GaR kodieren (Ergänzungstabelle). 2) wurden wie folgt hergestellt. Gene wurden entworfen und synthetisiert (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), um ihren GC-Gehalt zu verringern und ihre Codons zu optimieren, um die Genexpression in E. coli zu verbessern. Die entworfenen Gene mit NdeI- und BamHI-Stellen an den 5'- bzw. 3'-Termini wurden mit NdeI und BamHI verdaut und mit pET-21a(+) ligiert, das mit denselben Restriktionsenzymen verdaut wurde. Für alle 10 resultierenden Expressionsplasmide (Ergänzungstabelle 2) mit den beiden oben beschriebenen Plasmiden führten wir eine DNA-Sequenzanalyse durch und bestätigten das Fehlen einer unbeabsichtigten Mutation. Die entworfenen Sequenzen jedes Gens sind in der ergänzenden Abbildung 22 dargestellt.

Die konstruierten Expressionsplasmide wurden in E. coli Rosetta (DE3) (für Gene, die R15P-Isomerase, RbsK, HAD-Hydrolase und FucA kodieren) oder E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (für Gene, die Urdpase1 und GaR kodieren) eingeführt. Die Transformanten wurden bei 37 °C kultiviert, bis ihre OD660 0,4–0,8 erreichte, und die Genexpression wurde durch die Zugabe von Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert. Nach weiterer Kultivierung bei 37 °C für 4 Stunden wurden die Zellen geerntet.

Zellen, die die rekombinanten Proteine ​​Hs-GaR, Ht-R15P-Isomerase, Hx-RbsK und Hx-FucA exprimieren, wurden mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Nach der Zentrifugation (5000 x g, 15 Min., 4 °C) wurde der Überstand auf eine Anionenaustauschersäule (Resource Q, GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert war. Proteine ​​wurden mit einem linearen Gradienten von NaCl (0 bis 1,0 M) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) eluiert. Für die drei Proteine ​​außer GaR wurden die Puffer der relevanten Fraktionen durch Natriumphosphatpuffer mit 2 M NaCl ersetzt und auf eine mit äquilibrierte keramische Hydroxylapatit-Affinitätssäule (Bio-Scale CHT 10-1, Bio-Rad, Hercules, CA) aufgetragen 7 mM Natriumphosphat (pH 7,5) einschließlich 2 M NaCl. Die Proteine ​​wurden mit einem linearen Gradienten von Natriumphosphat (7 bis 280 mM) in 2 M NaCl eluiert. Relevante Fraktionen wurden gesammelt und mit einer Gelfiltrationssäule Superdex200 (GE Healthcare), äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) einschließlich 2 M NaCl, weiter gereinigt. Als mobile Phase wurde der gleiche Puffer verwendet. Für Hs-GaR wurden relevante Fraktionen nach der Anionenaustauschchromatographie auf eine Gelfiltrationssäule aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) einschließlich 2 M KCl äquilibriert war.

Rekombinante Hl-Urdpase1- und Hx-HAD-Hydrolase-Proteine ​​wurden mit Bio-Scale CHT 10-1 und Superdex200 gereinigt. Zellen, die die Proteine ​​Hl-Urdpase1 und Hx-HAD-Hydrolase produzieren, wurden in 5 mM bzw. 7 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 2 M NaCl resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände auf Bio-Scale CHT 10-1 aufgetragen und mit den gleichen Puffern äquilibriert, die auch für die Zellsuspension verwendet wurden. Hl-Urdpase1 und Hx-HAD-Hydrolase wurden mit linearen Gradienten von Natriumphosphat (5 bis 500 mM bzw. 7 bis 280 mM) in 2 M NaCl eluiert. Hl-Urdpase1 und Hx-HAD-Hydrolase wurden mit einer Superdex200-Säule, die mit 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 2 M KCl bzw. 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit 2 M KCl äquilibriert war, mit den verwendeten Puffern weiter gereinigt als mobile Phasen.

Die Konzentrationen der gereinigten Enzyme wurden mit dem Protein Assay System (Bio-Rad) bestimmt, wobei Rinderserumalbumin (BSA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) als Standard verwendet wurde. Die Proteinhomogenität wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigt.

H. salinarum wurde in 200 ml salzreichem Medium, ergänzt mit vier Nukleosiden (Adenosin, Uridin, Guanosin und Cytidin: jeweils 0,5 mM), kultiviert. Nachdem die Zelldichte (OD660) 0,7 erreicht hatte, wurden die Zellen geerntet, mit 5 ml 5 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 2 M KCl resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Nach der Zentrifugation (5000 x g, 15 Min., 4 °C) wurde der Überstand auf eine Bio-Scale CHT 10-1-Säule aufgetragen, die mit 5 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 2 M KCl äquilibriert war. Proteine ​​wurden mit einem linearen Gradienten von Natriumphosphat (5 bis 500 mM) in 2 M KCl eluiert. Fraktionen, die Glykolaldehyd-Reduktase-Aktivität zeigten, wurden gesammelt. Die weitere Reinigung wurde mit einer Superdex200-Säule durchgeführt, die mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) einschließlich 2 M NaCl äquilibriert war. Als mobile Phase wurde der gleiche Puffer verwendet. Die Proteinkonzentration wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Die Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins, das Glykolaldehydreduktaseaktivität aufweist, wurde durch LC-MS-Analyse identifiziert. Nach der Trennung mittels SDS-PAGE wurden die Proteine ​​mit Silberfärbung gefärbt. Der Teil des Gels, der das Zielprotein enthielt, wurde herausgeschnitten und mit dem Silver Stain MS Kit entfärbt. Das Protein im Gel wurde reduziert, alkyliert, mit Trypsin verdaut und mit dem In-Gel Tryptic Digestion Kit (Thermo Fisher Scientific) extrahiert. Die mit Trypsin verdauten Peptide wurden durch Nanofluss-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und anschließende Tandem-MS unter Verwendung eines LTQ-Orbitrap XL-Hybrid-Massenspektrometers (Thermo Fisher Scientific) analysiert. Die Proben wurden mithilfe des PAL-Systems (CTC Analytics, Zwingen, Schweiz) automatisch in eine Peptid-L-Trap-Säule OSD (5 µm; AMR, Tokio, Japan) injiziert, die an ein Injektorventil zum Entsalzen und Konzentrieren von Peptiden angeschlossen war. Nach dem Waschen der Falle mit Wasser in MS-Qualität, das 0,1 % TFA-Säure und 2 % Acetonitril (Lösungsmittel C) enthielt, wurden die Peptide in eine Nano-HPLC-Kapillarsäule (C18-gepackt mit einer Gelpartikelgröße von 3 µm, 0,1 × 150 mm) geladen. Nikkyo Technos, Tokio, Japan). Die Eluenten waren: A, 100 % Wasser mit 0,5 % Acetat und B, 80 % Acetonitril mit 0,5 % Acetat. In der Säule wurde der Konzentrationsgradient von Acetonitril erhöht: von 5 % B auf 45 % B in 60 Minuten, von 45 % B auf 95 % B in 1 Minute, Aufrechterhaltung von 95 % B für 19 Minuten, von 95 % B auf 5 % B in 1 Minute und schließlich erneutes Äquilibrieren mit 5 % B für 9 Minuten. Die Flussrate wurde mit einem Konzentrationsgradienten von Acetonitril von 200 auf 500 nl/min beschleunigt. Das Xcalibur 2.1-System (Thermo Fisher Scientific) wurde zur Analyse von Peptidspektren im Massenbereich von m/z 350–1500 und zur Analyse der MS/MS-Spektren bei der informationsabhängigen Datenerfassung im Massenbereich von m/z 150–2000 verwendet. Die Fragmentierung erfolgte durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID). Für MS/MS-Experimente wurden mehrfach geladene Peptide mit guten Fragmentierungseigenschaften ausgewählt. MS/MS-Spektren wurden interpretiert und Peaklisten wurden mit Proteome Discoverer 1.4 und 2.0 (Thermo Fisher Scientific) erstellt. Die Gensuche wurde mit SEQUEST-HT (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.

Die R15P-Isomeraseaktivität wurde unter Verwendung von Ribose-1,5-bisphosphat (R15P) als Substrat und dem Nachweis des Produkts RuBP mit HPLC untersucht. Die Reaktionsmischung (100 μl) bestand aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM R15P (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japan), 10 mM MgCl2, 1,84 M KCl und 2 oder 3 μg der gereinigten Rekombinante Ht-R15P-Isomerase-Protein. Die Reaktionsmischung ohne R15P wurde 3 Minuten lang bei 47 °C vorinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von R15P gestartet, 15 Minuten lang bei 47 °C durchgeführt und durch schnelles Abkühlen auf Eis und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration mit der Amicon Ultra-0.5-Zentrifugalfiltereinheit (MWCO: 10 K) (EMD Millipore) gestoppt , Billerica, MA). Das Reaktionsprodukt wurde mittels HPLC unter Verwendung einer Asahipak NH2P-50 4E-Säule (Shodex, Tokio, Japan) mit 300 mM Natriumphosphat (pH 4,4) als mobiler Phase analysiert. Die eluierten Verbindungen wurden mit einem Differentialbrechungsindexdetektor überwacht. HPLC-Chromatogrammdaten, gemessen mit LC-10A- oder Nexera X2-Systemen (Shimadzu, Kyoto, Japan) wurden mit LCsolution 1.22 SP1 oder LabSolutions 5.57 erfasst.

Die Kinaseaktivität von Hx-RbsK wurde durch Quantifizierung der Menge an NDPs gemessen, die aus NTPs mit Kopplungsenzymen, Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase (PK/LDH), produziert wurden. PK wandelt Phosphoenolpyruvat und NDPs in Pyruvat und NTPs um. LDH katalysiert die Umwandlung von Pyruvat und NADH in Laktat und NAD+. Die erzeugten NDPs wurden durch Messung der von NADH abgeleiteten Abnahme der Absorption bei 340 nm (A340) berechnet.

Um die Aktivität von Hx-RbsK zu messen, wurde die NDP-Produktion wie folgt untersucht. Die Kinase-Reaktionsmischung (100 μl) enthielt eine Mischung aus 50 mM Tris-HCl und 50 mM Bicin-NaOH (pH 8,3 oder 8,4), 25 mM Phosphatakzeptoren einschließlich Ribose-1-phosphat (R1P) (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Kanada), NTP (4 mM ATP [ORIENTAL YEAST, Tokio, Japan], 4 mM ATP mit je 2 mM GTP/UTP/CTP, je 2 mM ATP/GTP/UTP/CTP/TTP oder 4 mM ATP mit jeweils 1,5 mM GTP/UTP/CTP/TTP), 20 mM MgCl2, 1,8 M oder 4 M NaCl und 2, 2,5 oder 4 μg teilweise gereinigtes Hx-RbsK-Protein. 85 als Substrate und Reaktionsbedingungen getestete Phosphatakzeptoren sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Das Reaktionsgemisch ohne NTP wurde 3 Minuten lang bei 42 oder 47 °C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von NTP gestartet und 15 Minuten lang durchgeführt. 30 oder 60 Min. Die Reaktion wurde durch schnelles Abkühlen auf Eis für 10 Minuten und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration wie oben beschrieben gestoppt. Die PK/LDH-Reaktionsmischung (100 μl) bestand aus 15 oder 50 mM MES-NaOH (pH 6,5), 25–50 μl der Kinase-Reaktionsmischung, 5 oder 20 mM Phosphoenolpyruvat (PEP), 0,2 mM NADH (ORIENTALISCHE HEFE). ), 5 Einheiten PK und 7 Einheiten LDH. A340 des PK/LDH-Reaktionsgemisches ohne Kopplungsenzyme wurde gemessen. Die Kopplungsenzyme wurden hinzugefügt und A340 wurde bei Raumtemperatur überwacht, bis keine Abnahme mehr beobachtet wurde. Sofern nicht anders beschrieben, wurde die Absorption mit einem Spektrophotometer, Ultrospec 3000 (GE Healthcare) oder Ultrospec 6300 pro (GE Healthcare), gemessen. Der angewandte molare Absorptionskoeffizient von NADH betrug ε340 nm = 6,22 × 103 M−1 cm−1. Die Reaktion wurde ohne Phosphatakzeptorsubstrat durchgeführt und der Wert von den mit den Akzeptorsubstraten erhaltenen Werten abgezogen. Die Mengen der produzierten NDPs wurden durch Division durch die Reaktionszeit (Minuten) und die Proteinmenge (mg) normalisiert.

Zur Untersuchung der NTP-Spezifität wurde die Reaktion 5 Minuten lang bei 42 °C in Gegenwart von 25 mM R1P, 4 mM NTPs, 0,8 M NaCl, 1,2 μg gereinigtem Protein und anderen oben beschriebenen Komponenten durchgeführt. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität gegenüber R1P wurde die Reaktion 3, 4 und 5 Minuten lang bei 47 °C durchgeführt, wobei die Reaktionsmischung 20 mM R1P, 4 mM ATP, 2 M KCl und andere oben beschriebene Komponenten enthielt. Um die KCl-Abhängigkeit zu bestimmen, wurde NaCl durch KCl (0–3 M) ersetzt und spezifische Aktivitäten wurden bei 47 °C in Gegenwart von 15 mM R1P, 4 mM ATP und anderen oben beschriebenen Komponenten gemessen. Bei der Analyse des Hx-RbsK-Reaktionsprodukts mit HPLC waren 10 mM R1P, 30 mM ATP, 2 M KCl, 1 μg gereinigtes Protein und andere oben beschriebene Komponenten in der 100 μl-Reaktionsmischung enthalten. Die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 47 °C durchgeführt. Nach schnellem Abkühlen auf Eis für 10 Minuten und Ultrafiltration zur Entfernung von Hx-RbsK wurde das Filtrat wie oben beschrieben mit HPLC analysiert. Für die gekoppelte Reaktion von Hx-RbsK und Ht-R15P-Isomerase wurden 50-μl-Aliquots des Filtrats in ein Ht-R15P-Isomerase-Reaktionsgemisch mit 5 mM AMP und ohne R15P gegeben. Nach 3-minütiger Inkubation bei 47 °C wurde die Reaktion gestartet und 15 Minuten lang durchgeführt. Die RuBP-Bildung wurde durch HPLC wie oben beschrieben nachgewiesen.

Die Nukleosidphosphorylaseaktivität von Hl-Urdpase1 wurde durch Quantifizierung der freigesetzten Nukleobase mittels HPLC gemessen. Sofern nicht anders beschrieben, enthielt die Reaktionsmischung (100 μl) 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 2 mM Nukleoside (Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder Thymidin), 2 M KCl und 1 μg gereinigtes Enzym. Nach 3-minütiger Inkubation des Reaktionsgemisches ohne Nukleoside bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von Nukleosiden gestartet. Nach Inkubation bei 37 °C für verschiedene Zeiträume wurde die Reaktion durch schnelles Abkühlen auf Eis für 20 Minuten und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration wie oben beschrieben gestoppt. Für die HPLC wurde dem Filtrat ein gleiches Volumen einer 20 %igen Methanollösung mit 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) zugesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC unter Verwendung einer COSMOSIL 5C18-PAQ-gepackten Säule (4,6 ID x 250 mm, Nacalai Tesque), äquilibriert mit 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 10 % Methanol, bei einer Temperatur von 40 °C analysiert. Die freigesetzten Nukleobasen wurden durch UV-Absorption bei 260 nm nachgewiesen. Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, Guanosin, Guanin, Uridin, Uracil, Cytidin, Cytosin, Thymidin und Thymin wurden als Standardverbindungen zur Erstellung von Standardkurven verwendet.

Bei der Bestimmung allgemeiner enzymatischer Eigenschaften werden unterschiedliche KCl-Konzentrationen (0–4 M), Reaktionstemperaturen (20–90 °C) und Reaktions-pH (Natriumphosphatpuffer für pH 2,0–5,0, MES-NaOH-Puffer für pH 5,5–7,0, HEPES) berücksichtigt -NaOH-Puffer für pH 7,0–8,0, Bicin-NaOH-Puffer für pH 8,0–9,0) wurden getestet. Für die kinetische Analyse von Guanosin wurden verschiedene Guanosinkonzentrationen (0–1000 μM) bei 30 °C in Gegenwart von 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 2 M KCl getestet. Die kinetische Analyse in Bezug auf Phosphat wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Natriumphosphat (0–32 mM) in Gegenwart von 1 mM Guanosin bei 30 °C mit 2 M KCl durchgeführt. Bei allen kinetischen Analysen von Enzymen wurden die Kurvenanpassung und die Berechnung der Vmax- und Km-Werte mit IGOR Pro Version 6.03AJ durchgeführt.

Die Phosphataseaktivität der Hx-HAD-Hydrolase wurde durch Quantifizierung des freigesetzten Phosphats mit einem Malachitgrün-Assay bestimmt. Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM Zuckerphosphate, 2 M KCl, 5 mM MgCl2 und 1 μg des gereinigten rekombinanten Hx-HAD-Hydrolase-Proteins. Zwölf Substrate, Glucose-1-phosphat (G1P), Glucose-6-phosphat (G6P), Glucose-1,6-bisphosphat (G16P), Fructose-1-phosphat (F1P), Fructose-6-phosphat (F6P), Fructose-1,6-bisphosphat (F16P), Ribose-5-phosphat (R5P), Ribose-1-phosphat (R1P), Ribose-1,5-bisphosphat (R15P), Ribulose-5-phosphat (Ru5P), Ribulose -1,5-Bisphosphat (RuBP) und p-Nitrophenylphosphat (pNPP) wurden untersucht. Nach 5-minütiger Inkubation des Reaktionsgemisches ohne Substrate bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des Substrats gestartet. Nach 10-minütiger Inkubation wurde die Reaktion durch schnelles Abkühlen auf Eis und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration wie oben beschrieben gestoppt. Freigesetztes freies Phosphat wurde mit Malachite Green Phosphate Assay Kits (BioAssay Systems, Hayward, CA) quantifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden entsprechend auf ein Endvolumen von 80 μl verdünnt und dann mit 20 μl des angegebenen Reagenzes gemischt. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 660 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.

Zur Bestimmung der allgemeinen enzymatischen Eigenschaften wurde die Reaktion in einem 100-μl-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) oder 50 mM MES (pH 6,1), 10 mM RuBP, 2,5 M KCl, 5 mM MgCl2 usw. enthielt 0,5 μg des gereinigten Enzyms. Die Auswirkungen von Salzen wurden durch Variation der KCl-Konzentration (1–3 M) oder Verwendung von NaCl (3 M) untersucht. Die Auswirkungen des pH-Werts wurden mit 50 mM Essigsäure (pH 4,4–5,9), MES (pH 6,1–7,4) oder PIPES (pH 7,5–8,5) untersucht. Die Auswirkungen zweiwertiger Metallkationen wurden mit 5 mM MgCl2, CaCl2, MnCl2, CoCl2, NiCl2 oder EDTA untersucht. Die kinetische Analyse von RuBP wurde in einem 100-μl-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), verschiedene Konzentrationen von RuBP (0–20 mM), 2 M KCl, 5 mM MgCl2 und 0,5 μg des gereinigten Enzyms enthielt . Nach 5-minütiger Vorinkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von RuBP gestartet. Die Reaktionszeiten betrugen 1, 3 und 5 Minuten für Reaktionen mit 0,1–0,5 mM RuBP und 1, 4 und 7 Minuten für Reaktionen mit anderen Konzentrationen.

Die Aldolaseaktivitäten von Hx-FucA wurden mit Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und verschiedenen Aldehyden als Substraten gemessen. Das nach der Kondensationsreaktion verbleibende DHAP wurde mit Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPDH) durch Messung des NADH-Verbrauchs quantifiziert. Die Aldolase-Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM DHAP, 25 mM Aldehyde (Acetaldehyd, Propionaldehyd, Isobutylaldehyd, DL-Glycerinaldehyd, DL-Lactaldehyd oder Glykolaldehyd), 2 M KCl, 1 mM ZnCl2 und 4 μg gereinigtes Enzym. Nach 3-minütiger Inkubation des Reaktionsgemisches ohne Aldehyde bei 47 °C wurde die Reaktion durch Zugabe einzelner Aldehyde gestartet. Nach weiterer Inkubation bei 47 °C (3–20 Minuten) wurde die Reaktion durch schnelles Abkühlen auf Eis für 5 Minuten und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration wie oben beschrieben gestoppt. Die Kopplungsreaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 μl eines entsprechend verdünnten Aliquots der ersten Reaktionsmischung, 0,2 mM NADH und 1,7 Einheiten GPDH. Nach der Zugabe von GPDH wurde A340 mit einem Ultrospec 6300 pro überwacht, bis keine Abnahme mehr beobachtet wurde, und das verbleibende DHAP wurde anhand der Menge an verbrauchtem NADH quantifiziert.

Die mit der Hx-FucA-Reaktion gekoppelte Hx-HAD-Hydrolase-Reaktion wurde durch den Nachweis der DHAP-Produktion aus RuBP untersucht. Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM RuBP, 5 mM MgCl2, 2 M KCl, 1 mM ZnCl2, jeweils 1 μg Hx-HAD-Hydrolase und Hx-FucA. Nach 3-minütiger Inkubation ohne RuBP bei 47 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von RuBP gestartet. Nach 3-stündiger Inkubation wurde die Reaktion durch schnelles Abkühlen auf Eis und Entfernen des Enzyms durch Ultrafiltration gestoppt. Die Reaktionsmischung (100 μl) zur Quantifizierung von DHAP enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40 μl der ersten Reaktionsmischung, 0,3 mM NADH und 1,7 Einheiten GPDH. Die DHAP-Produktion wurde wie oben beschrieben quantifiziert.

Die kinetischen Parameter des Hx-FucA-Proteins gegenüber DHAP und Glykolaldehyd wurden wie folgt bestimmt. Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), die Substrate Glykolaldehyd und DHAP, 2 M KCl, 1 mM ZnCl2 und 2 μg gereinigtes Hx-FucA-Protein. Verschiedene Konzentrationen von DHAP (1–20 mM) oder Glykolaldehyd (1–30 mM) wurden mit einer konstanten Konzentration von Glykolaldehyd (50 mM) bzw. DHAP (20 mM) getestet. Nach 3-minütiger Inkubation bei 47 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von DHAP oder Glykolaldehyd gestartet. Nach 12, 16 und 20 Minuten Inkubation wurde die Reaktion durch schnelles Abkühlen auf Eis für 5 Minuten und Entfernen der Proteine ​​mit Ultrafiltrationssäulen gestoppt. Das produzierte Ru1P wurde durch HPLC unter Verwendung einer Asahipak NH2P-50 4E-Säule und eines UV-Detektors (200 nm) quantifiziert. Die Säule wurde mit 300 mM Natriumphosphatpuffer (pH 4,4) bei 40 °C äquilibriert und der gleiche Puffer wurde als mobile Phase verwendet.

Da Ru1P nicht im Handel erhältlich ist, wurde das Hx-HAD-Hydrolaseprotein zur Herstellung von Ru1P zum Erstellen einer Standardkurve von Ru1P verwendet. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM MES-NaOH-Puffer (pH 6,0), 10 mM RuBP, 2 M KCl, 5 mM MgCl2 und 1 μg Hx-HAD-Hydrolase-Protein. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37 °C ohne RuBP wurde die Reaktion durch Zugabe von RuBP gestartet. Nach 5-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch schnelles 5-minütiges Abkühlen auf Eis und Entfernen der Proteine ​​mit einer Ultrafiltrationssäule gestoppt. Nachdem der vollständige Verbrauch von RuBP durch HPLC bestätigt wurde, wurde die Konzentration des erzeugten Ru1P auf 10 mM geschätzt und zur Erstellung einer Standardkurve für Ru1P verwendet.

Die Reduktaseaktivitäten gegenüber Glykolaldehyd und DHAP wurden durch Überwachung des NADH-Verbrauchs (A340) in der Reaktionsmischung mit einem UV-Spektrophotometer, UV-1800 (Shimadzu), gemessen und die Daten wurden mit UVProbe 2.52 gesammelt. Die Reaktionsmischung (1 ml) enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) oder 50 mM/100 mM MES-NaOH (pH 6,0), 7,5 oder 20 mM Glykolaldehyd/7,5 mM DHAP, 0,2 mM NADH, 2 M KCl und 0,2 oder 2 μg gereinigte Glykolaldehydreduktase. Nach einminütiger Inkubation des Reaktionsgemisches ohne NADH oder rekombinantes Protein bei 40 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von NADH bzw. gereinigtem rekombinantem Protein gestartet. Die Datenanalyse wurde mit der Software UVProbe 2.52 durchgeführt.

Auswirkungen von KCl-Konzentrationen (0–4 M) in 50 mM MES-NaOH (pH 6,5) bei 30 °C, Reaktionstemperaturen (20–90 °C) mit 50 mM MES-NaOH (pH 6,5) und 4 M KCl und pH-Werte (MES-NaOH [pH 5,5–7,0], HEPES-NaOH [7,0–8,0], Bicin-NaOH [8,0–9,0] bei 40 °C und in Gegenwart von 4 M KCl wurden getestet. Kinetische Parameter gegenüber Glykolaldehyd bei 40 °C wurden in einem Reaktionsgemisch (1 ml) bestimmt, das 50 mM MES-NaOH (pH 6,0), verschiedene Konzentrationen von Glykolaldehyd (0–70 mM), 0,2 mM NADH, 3 M KCl und 0,2 μg des gereinigten Produkts enthielt Enzym.

Die Oxidaseaktivität gegenüber sn-Glycerin-1-phosphat wurde wie folgt untersucht. Die Reaktionsmischung (1 ml) enthielt 50 mM MES-NaOH (pH 6,0), 7,5 mM sn-Glycerin-1-phosphat, 0,2 mM NAD+, 2 M KCl und 0,2 μg gereinigte Glykolaldehydreduktase. Nach 1-minütiger Inkubation der Reaktionsmischung ohne NAD+ bei 40 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von NAD+ gestartet und das von NADH abgeleitete A340 mit einem UV-1800 gemessen, um die DHAP-Produktion zu berechnen, und Daten wurden mit UVProve 2.52 gesammelt.

Das Reaktionsprodukt der Hx-HAD-Hydrolase wurde mittels NMR analysiert. Die Reaktionsmischung (300 μl) enthielt 100 mM Ammoniumacetat (pH 6,65), 10 mM RuBP, 2 M KCl, 5 mM MgCl2 und 1 μg des gereinigten Enzyms. Nach 5-minütiger Inkubation des Reaktionsgemisches ohne RuBP bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von RuBP gestartet. Nach 10-minütiger Inkubation wurde die Reaktion durch Entfernen des Enzyms mit einer Ultrafiltrationssäule wie oben beschrieben gestoppt. Das Reaktionsprodukt wurde dreimal durch Vakuumtrocknung konzentriert, entsprechend mit D2O (D, 99,96 %) verdünnt (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Tewksbury, MA) und mit 1H-NMR analysiert.

Die 1H-NMR-Messung wurde mit einem ECA-600-Spektrometer (JEOL, Tokio, Japan) bei 600 MHz und 5 °C durchgeführt und die Daten mit Delta 4 gesammelt. Die 1H-NMR-Spektren wurden unter Verwendung einer Pulssequenz mit Vorsättigung für Wasser aufgenommen Unterdrückung. Die Vorsättigungsleistung betrug 56 dB, was das Minimum ist, das zur vollständigen Unterdrückung des Wasserpeaks erforderlich ist. Die chemischen Verschiebungen der 1H-NMR-Spektren wurden in ppm relativ zu den Signalen von Lösungsmitteln unter Verwendung externer Standards von D2O bei 4,62 ppm angegeben. Die erhaltenen NMR-Daten wurden mit Alice2 Version 6 analysiert.

H. salinarum wurde in einem Medium mit hohem Salzgehalt, ergänzt mit 2 mM Adenosin, 100 mM Uridin, 2 mM Guanosin und 100 mM Cytidin, kultiviert. Bei der Messung der Guanosinphosphorylase-Aktivität wurden Zellen ohne Nukleoside kultiviert, um Hintergrundsignale zu verringern, die von den zugesetzten Nukleosiden herrühren. Zellfreie Extrakte wurden wie für die Reinigung von GaR beschrieben hergestellt. Um Hintergrundpeaks zu reduzieren, wurden kleine Moleküle im Zellextrakt durch achtfache Verdünnung mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) durch Ultrafiltration reduziert. Die Reaktionsmischung (100 μl) enthielt 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 1500 μg des zellfreien Extrakts und Substrat. Substrate, ihre Konzentrationen und Reaktionszeiten/-temperaturen waren 1 mM Guanosin für Guanosinphosphorylase (5 h/40 °C), 40 mM R1P mit 20 mM ATP und 20 mM MgCl2 für R1P-Kinase (17 h/47 °C), 40 mM R15P für R15P-Isomerase (12 h/40 °C), 20 mM RuBP und 20 mM MgCl2 für RuBP-Phosphatase (15 min/40 °C), 100 mM RuBP mit 20 mM MgCl2 und 1 mM ZnCl2 für Ru1P-Aldolase (12 h). /40 °C), 40 mM Glykolaldehyd und 30 mM NADH für Glykolaldehydreduktase (1 h/40 °C). Vor der Zugabe der Substrate wurde eine 3-minütige Inkubation durchgeführt; Guanosin, ATP, R15P, RuBP, RuBP bzw. NADH. Die Reaktionen wurden durch schnelles 10-minütiges Abkühlen auf Eis und Entfernen der Enzyme durch Ultrafiltration gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC unter Verwendung einer COSMOSIL 5C18-PAQ-gepackten Säule und einer mobilen Phase aus H2O bei 40 °C auf Glykolaldehydreduktase sowie einer Asahipak NH2P-50 4E-Säule und einer mobilen Phase aus 300 mM Natriumphosphat (pH 4,4) bei 40 °C analysiert °C für die anderen Proteine. Die Produkte (R1P, R15P, RuBP, Ru1P, DHAP und Ethylenglykol) wurden mit einem Differentialbrechungsindexdetektor überwacht. Standardverbindungen waren im Handel erhältliches R1P (10 mM), R15P (10 mM), DHAP (5 mM) und Ethylenglykol (15 mM) sowie Ru1P, das enzymatisch aus RuBP (5 mM) hergestellt wurde (oben beschrieben).

Proteinhomologiesuchen wurden anhand der KEGG Genes-Datenbank unter Verwendung des BLAST Search-Programms (https://www.genome.jp/tools/blast/) durchgeführt. Sequenzen von 16S-ribosomalen RNA-Genen von Halophilen wurden aus der KEGG Genes-Datenbank erhalten. Wenn in einem Organismus mehrere ribosomale 16S-RNAs vorhanden waren, wurde eine Sequenz zufällig ausgewählt. Die phylogenetische Analyse wurde mit dem Programm ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) durchgeführt, während der phylogenetische Baum mit TreeView Version 1.6.6 erstellt wurde.

Die Reproduzierbarkeit der Daten wurde durch die Durchführung von n = 3 unabhängigen Experimenten zur Datenerfassung und Bestimmung und Bereitstellung von Mittelwerten und Standardabweichungen gewährleistet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Gen locus_tag und Organismuscode wurden von denen in einer Datenbank, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (https://www.genome.jp/kegg/), übernommen. Unbeschnittene Gelbilder der in den ergänzenden Abbildungen gezeigten Gelbilder. 2 und 3 sind in der ergänzenden Abbildung 23 dargestellt. Alle Daten für Balkendiagramme in Abb. 4a – c sind in den ergänzenden Daten 1 dargestellt. Künstliche Gensequenzen, die für Ht-R15P-Isomerase, Hs-RbsK, Ht-RbsK, Hx-RbsK kodieren, Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD-Hydrolase, Hx-FucA und Hs-GaR sind in der GenBank mit den Zugangsnummern LC735265, LC735266, LC735267, LC735268, LC735269, LC735270, LC735271, LC7 hinterlegt 35272, LC735273 bzw. LC735274.

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Die Autoren danken Frau Eriko Kusaka und Herrn Haruo Fujita für die NMR-Analyse. Wir danken Prof. Itaru Hamachi für die Bereitstellung der Geräte für die LC-MS-Analyse. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Grant-Nummer: 18K05411) und Noda Institute for Scientific Research to TS sowie vom CREST-Programm der Japan Science and Technology Agency (Grant-Nummer: 10104047), JSPS KAKENHI-Grant-Nummer 18H03934 und JP19H05679 (Post-) unterstützt. Koch Ecology), JP19H05684 bis HA

Abteilung für synthetische Chemie und biologische Chemie, Graduate School of Engineering, Universität Kyoto, Kyoto, Japan

Takaaki Sato, Sanae (Hodo) Utashima, Yuta Yoshii, Kosuke Hirata, Shuichiro Kanda, Yushi Onoda, Jian-qiang Jin, Suyi Xiao, Ryoko Minami, Hikaru Fukushima und Haruyuki Atomi

Integriertes Forschungszentrum für CO2-negative Wissenschaft, Universität Kyoto, Kyoto, Japan

Takaaki Sato & Haruyuki Atomi

Fachbereich Chemie, Graduate School of Science, Universität Osaka, Osaka, Japan

Ayako Noguchi, Yoshiyuki Manabe und Koichi Fukase

Forefront Research Center, Universität Osaka, Osaka, Japan

Yoshiyuki Manabe & Koichi Fukase

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HA und TS haben die Arbeit entworfen. SU analysierte die R15P-Isomerase. SU, AN, YM, KF untersuchten die R1P-Kinase. YY, SU untersuchten RuBP-Phosphatase. YY, SU, JJ untersuchten Ru1P-Aldolase. SK, HF untersuchten Guanosinphosphorylase. KH, RM untersuchten native Glykolaldehydreduktase. SX untersuchte rekombinante Glykolaldehydreduktase. YO untersuchte Enzymaktivitäten in H. salinarum-Zellen. TS, SU, YY, KH, SK, YO, JJ, SX, HA haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Haruyuki Atomi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Bettina Siebers und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Nishith Gupta und Karli Montague-Cardoso.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sato, T., Utashima, S.(., Yoshii, Y. et al. Ein nicht-carboxylierender Pentosebisphosphat-Weg in halophilen Archaeen. Commun Biol 5, 1290 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003 -022-04247-2

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Eingegangen: 28. Juli 2022

Angenommen: 10. November 2022

Veröffentlicht: 24. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04247-2

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