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Jun 18, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9322 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Präklinische pharmakokinetische (PK) Studien in Tiermodellen während der Formulierungsentwicklungsphase liefern vorläufige Beweise und ein nahezu klares Bild des PK-Verhaltens von Arzneimitteln und/oder seinen Dosierungsformen vor klinischen Studien am Menschen und helfen bei der Anpassung der Dosierungsform entsprechend erwartetes und erforderliches klinisches Verhalten. Die vorliegende Arbeit berichtet über eine erste präklinische PK-Studie dieser Art zu festen oralen Dosierungsformen von Venlafaxin (VEN) mit verlängerter Freisetzung (ER) an weißen Neuseeland-Kaninchen. Das VEN ist ein häufig verschriebenes und eines der sichersten und wirksamsten Therapeutika, das weltweit zur Behandlung verschiedener Arten von Depressionsstörungen eingesetzt wird. Die zu diesem Zweck entwickelte LC-MS/MS-Methode zur Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) zeigte ausreichende Zuverlässigkeit bei der gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und seinem äquipotenten Metaboliten O-Desmethylvenlafaxin (ODV) in Kaninchenplasma. Die beschriebene Methode nutzt eine Festphasenextraktion zur Probenvorbereitung, gefolgt von einer ultraschnellen LC-MS/MS-Analyse. Die chromatographische Trennung wurde isokratisch mit einer überwiegend polaren mobilen Phase durch den Einsatz von RPLC erreicht. Das im MRM-Modus betriebene Triple-Quadrupol-LC/MS/MS-System nutzte eine ESI-Sonde als Ionenquelle mit positiver Polarität. Die Validierungsergebnisse liegen innerhalb der zulässigen Grenzen der Empfehlungen und Akzeptanzkriterien der US-amerikanischen FDA für die Validierung bioanalytischer Methoden.

Die präklinischen Tests zur Arzneimittelfreisetzung in oralen festen Darreichungsformen mit verlängerter Wirkstofffreisetzung (ER), zu denen auch Tabletten und Kapseln gehören, umfassen In-vitro-Auflösungs- und In-vivo-Pharmakokinetikstudien (PK) in geeigneten Tiermodellen. Das bevorzugte Tiermodell sollte in der Lage sein, die spezielle Art der ER-Formulierung unterzubringen, die sich in der präklinischen Untersuchung befindet1,2,3. Die aus präklinischen PK-Studien gewonnenen Daten liefern vorläufige Hinweise auf die Absorptionsraten und -orte des Arzneimittels sowie auf einen möglichen Mechanismus der Arzneimittelverteilung, des Metabolismus und der Elimination. Diese in Tiermodellen gesammelten präklinischen PK-Daten helfen auch beim Screening von Prototyp-ER-Formulierungen, um die Entwicklung und Auswahl einer optimalen Dosierungsform für klinische PK-Studien am Menschen zu unterstützen4,5.

Venlafaxin (VEN), (RS) 1-[2-(Dimethylamino)-1-(4-methoxyphenyl)ethyl]cyclohexanol, das zur pharmakologischen Klasse der Serotonin-Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer (SNRIs) gehört, ist ein relativ neues und strukturell neuartiges Antidepressivum Das Medikament6 wurde 1993 von Wyeth eingeführt. Es hat chemisch nichts mit trizyklischen, tetrazyklischen und anderen Antidepressiva zu tun7,8 und ist derzeit ein häufig verschriebenes und eines der wirksamsten Medikamente mit weniger unerwünschten Nebenwirkungen, das bei der Behandlung von Depressionsstörungen eingesetzt wird9. Das VEN wird oral sowohl in der Dosierungsform mit sofortiger Freisetzung (IR) als auch in der ER-Dosierungsform verabreicht10,11. Die antidepressive Wirkung von VEN und seinem Hauptmetaboliten sowie einem äquipotenten aktiven Metaboliten, O-Desmethylvenlafaxin (ODV)12 (Abb. 1), beim Menschen hängt mit der Potenzierung der Neurotransmitteraktivität im Zentralnervensystem zusammen. Im menschlichen Plasma überwiegt ODV bei den meisten Menschen gegenüber VEN13, mit Ausnahme von langsam metabolisierenden Personen, bei denen VEN in höheren Konzentrationen als ODV14,15 gefunden wurde. Sowohl VEN als auch ODV sind starke Inhibitoren der Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahme und hemmen auch schwach die Dopamin-Wiederaufnahme16. Da Venlafaxin ein Racemat ist, sind die enantiomeren Formen R-(−) und S-(+) in gleichen Mengen vorhanden und tragen beide zu seiner antidepressiven Wirkung bei. Das R-Enantiomer von VEN hemmt wirksam die synaptosomale Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahme, während das S-Enantiomer die Serotonin-Wiederaufnahme selektiver hemmt. Allerdings hemmen beide Enantiomere von VEN die Serotonin-Wiederaufnahme wirksamer als die von Noradrenalin17,18,19. Die Enantiomere von ODV hemmen auch die Wiederaufnahme von Noradrenalin und Serotonin, wobei das R-Enantiomer wirksamer ist20.

Darstellung der chemischen Struktur von (a) Venlafaxin und (b) O-Desmethylvenlafaxin.

Die Drug Metabolism Division, Wyeth-Ayerst Research, Princeton, New Jersey, berichtete über die ersten präklinischen PK- und metabolischen Dispositionsstudien von VEN (WY-45.030) einschließlich seiner Enantiomere und ODV (WY-45.233) bei Mäusen, Ratten, Hunden und Rhesusaffen VEN und ODV befanden sich noch in der Entwicklung. Die Analyse von Plasma und Urin, die erhalten wurden, nachdem den Tieren eine reine wässrige Lösung von VEN und ODV und nicht irgendeine Dosierungsformulierung intravenös (iv) und/oder intragastrisch (ig) verabreicht worden war, wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt. Methode mit UV-Detektion. Wyeth-Ayerst Research berichtete außerdem über eine HPLC-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von VEN und ODV im Plasma von Ratten, Hunden und Mäusen18,21,22,23. In den letzten 30 Jahren, nach der Zulassung für den klinischen Einsatz, wurde in der Literatur über eine beträchtliche Anzahl bioanalytischer Methoden zur Quantifizierung von VEN und ODV in menschlichem Plasma und Urin berichtet, dies gilt jedoch nicht für präklinische Tiermodelle. Nach einer umfassenden Durchsicht der bisher verfügbaren Literatur wurden die folgenden bioanalytischen Methoden zur Durchführung präklinischer PK-Studien von VEN und ODV an Tieren gefunden und fast alle von ihnen berichteten über die orale, iv-Verabreichung wässriger Lösungen von VEN und ODV in reiner Form oder IG-Route. da Fonseca und Bonato berichteten über eine In-vitro-Studie zur enantioselektiven Biotransformation von VEN in seine Metaboliten in mikrosomalen Leberpräparaten männlicher Wistar-Ratten unter Verwendung einer chiralen HPLC-Trennung mit UV-Detektion24. Zhang et al. entwickelten die HPLC-Methode mit massenspektrometrischer Detektion (LC-MS) für die pK-Untersuchungen von VEN-Feststoffdispersionen bei männlichen Wistar-Ratten25. Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) mit höherer Spezifität und Verbesserungen wie hohem Signal-Rausch-Verhältnis, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in Verbindung mit HPLC hat sich zu einem geeigneten und effektiveren Werkzeug für extrem niedrige Nachweisgrenzen entwickelt und wird in großem Umfang eingesetzt PK-Studien derzeit26. In vielen Veröffentlichungen wurde über HPLC- und Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC/UPLC)-Tandem-Massenspektrometriemethoden (LC-MS/MS) zur Quantifizierung von VEN und ODV in Rattenplasma berichtet. Shah et al. (2009) und Ahmad et al. haben über Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) und Festphasenextraktion (SPE) basierende LC-MS/MS-Methoden zur gleichzeitigen Schätzung von VEN und ODV in Rattenplasma berichtet27,28. Aryal et al. hat erfolgreich eine LC-MS/MS-Methode eingesetzt, um die PK-Parameter von VEN und ODV im Plasma und Gehirndialysat von Mäusen nach einer iv- und ig-Verabreichung des Arzneimittels zu untersuchen29. In einer anderen Studie berichteten da Fonseca und Bonato über die Entwicklung einer selektiveren und empfindlicheren Technik wie der LC-MS/MS-Methode zur Beurteilung der kinetischen Disposition von VEN, ODV und N-Desmethylvenlafaxin (NDV) im Rattenplasma nach oraler Verabreichung von VEN30, da die mit der zuvor entwickelten HPLC-UV-Methode24 erreichte Quantifizierungsgrenze nur für In-vitro-Biotransformationsstudien geeignet war. Eine LC-MS/MS-Methode wurde von Zhang et al. verwendet. um die Konzentration der Phenolester von ODV zu bestimmen, und Liu et al. um synthetische Prodrugs von ODV im Plasma, Gehirn und Hypothalamus männlicher Wistar-Ratten abzuschätzen, zusammen mit PK-Parametern bei Beagle-Hunden in beiden Experimenten nach Verabreichung der wässrigen Arzneimittellösungen ig und oral an Tiere31,32. Die Validierung einer UPLC-MS/ESI-Methode, die für die gleichzeitige Bestimmung von VEN und ODV in Rattenplasma entwickelt wurde, und ihre Verwendung in PK-Studien an männlichen Wistar-Ratten nach oraler Verabreichung der VEN-Lösung wurde von Dubey et al.33 durchgeführt. Pan et al. gaben an, eine vollständig validierte UPLC-MS/MS-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von Methadon, Fluoxetin, VEN und ihren Metaboliten in dotiertem Rattenplasma für Arzneimittelwechselwirkungsstudien entwickelt und diese zusätzlich auch auf PK-Studien angewendet zu haben34. Eine wirksame UHPLC-MS/MS-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und seinen fünf Metaboliten im Rattenplasma wurde von Gu et al. beschrieben. und auf die PK-Studie von VEN angewendet, das Ratten oral verabreicht wurde35. Chen et al. hat über eine UPLC-MS/MS-Methode berichtet, um den zugrunde liegenden Mechanismus der Wirkung von Vonoprazan auf VEN in Rattenlebermikrosomen sowie seinen Einfluss auf das PK-Profil von VEN und ODV bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten nach oraler Verabreichung von Arzneimitteln zu untersuchen36. Song et al. berichteten über eine SPE-basierte gaschromatographische Massenspektrometriemethode (GC-MS) zur Bestimmung von Venlafaxin in Rattenplasma und deren Anwendung zur Beurteilung der PK-Wechselwirkung zwischen VEN und Fluoxetin bei Sprague-Dawley-Ratten.37 Eine von Shahnawaz et al. wurde auch in der Literatur gefunden38.

Nerkar und Gattani haben in zwei separaten Studien über ein vergleichendes PK-Profil von iv-, oralen Lösungs- und bukkalen mukoadhäsiven Gelformulierungen (auf Kresse- und Leinsamenbasis) mit VEN bei weißen Neuseeland-Kaninchen unter Verwendung einer HPLC-UV-Methode berichtet39,40. In einer anderen von Peng et al. berichteten PK-Studie wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von VEN bei Kaninchen eingesetzt, nachdem eine VEN-Kochsalzlösung und ein thermosensitives VEN-Chitosan-Hydrogel subkutan injiziert wurden41. Ali et al. hat auch eine HPLC-UV-Methode für PK-Studien von VEN-haltigen oralen Lösungen und Hydrogel-Kompositen mit verzögerter Freisetzung bei Kaninchen eingesetzt42. Eine HPLC-UV-Methode, die von Sher et al. in Kaninchenplasma entwickelt und validiert wurde. wurde auf die PK-Analyse von VEN bei Albino-Kaninchen nach oraler Verabreichung angewendet43.

Nach sorgfältiger Durchsicht der verfügbaren Literatur wurden nur zwei Berichte über präklinische PK-Studien eines Prototyps einer festen oralen ER-Dosisformulierung mit VEN gefunden, die in einem Tiermodell durchgeführt wurden. Bei der ersten handelt es sich um eine VEN ER-Tablette, über die in Rowley et al. berichtet wurde. US-Patent US 20050136109A1 von Wyeth. Das Patent erwähnt die PK-Studien von VEN ER-Tabletten, die an Beagle-Hunden durchgeführt wurden. In der Patentveröffentlichung wird jedoch kein Bericht über die bioanalytische Methode zur Schätzung von VEN und ODV aus Hundeplasma gegeben44. Die andere ist eine In-vivo-PK-Studie von Chitosan-Carbomer-Matrixtabletten, die VEN enthalten, durchgeführt von Zhang et al. bei Beagle-Hunden unter Verwendung einer HPLC-Methode45.

Die vorliegende Studie ist nach unserem besten Wissen der erste Bericht über präklinische PK-Studien zu ER-festen oralen Dosierungsformulierungen von Venlafaxin bei weißen Neuseeland-Kaninchen. Die Studie umfasst die Bioäquivalenzbewertung (BE) einer selbst hergestellten VEN ER-Tablette und des US-amerikanischen FDA-Referenzmedikaments (RLD) Efexor XR 37,5 mg unter Verwendung einer SPE-basierten robusten, zuverlässigen und validierten Ultrahochleistungs-LC-MRM-MS /MS-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und ODV in Kaninchenplasma.

Arbeitsstandards für Venlafaxinhydrochlorid und O-Desmethylvenlafaxin mit einer Reinheit von 99,83 % bzw. 99,82 % wurden von Vivan Life Sciences (Indien) bezogen. Deuteriummarkiertes Venlafaxin-D6-Hydrochlorid (VEN-D6) mit einer D-isotropen Anreicherung von 99,46 Atom-% und einer Reinheit von 99,68 % und Rac-O-Desmethylvenlafaxin-D6-Succinathydrat (ODV-D6) mit einer d-isotropen Anreicherung von 99,92 Atom-% und einer Reinheit von 99,02 % wurde ebenfalls von Vivan Life Sciences (Indien) bezogen und als interner Standard (IS) verwendet. Ammoniumformiat in Reagenzienqualität sowie Acetonitril und Methanol in HPLC-Qualität wurden von Honeywell Specialty Chemicals (GmbH) bezogen. Orthophosphorsäure und Ammoniak in Reagenzienqualität wurden von Thermo Fisher Scientific (Indien) erworben. Ameisensäure in Reagenzienqualität wurde von Sigma-Aldrich Chemicals (Indien) bezogen. Alle wässrigen Lösungen und Puffer wurden mit hochreinem Milli-Q-Wasser hergestellt. SPE-Kartuschen (Bond Elut PLEXA, 30 mg/1 cm³) wurden von Agilent (USA) bezogen. Natriumheparinhaltige Blutentnahmeröhrchen, BD VACUTAINER, wurden von Becton Dickinson (USA) bezogen. Efexor XR 37,5 mg wurde von Pfizer Ireland Pharmaceuticals (Irland) gekauft.

Stammlösungen (1 mg mL−1) von VEN und ODV wurden durch Auflösen genau abgewogener Standardverbindungen in Methanol hergestellt. Die Arbeitslösung im Bereich von 10–5000 ng mL−1 wurde durch Verdünnen der Stammlösung mit einem Verdünnungsmittel (50 % Methanol in Wasser, v:v) hergestellt. Die Kalibrierungsstandard- (CS) und Qualitätskontrollproben (QC) wurden aus Arbeitslösung unter Verwendung von Verdünnungsmittel und zugesetztem Kaninchenplasma (% Aufstockung ~ 5 %) hergestellt. Die Kalibrierungskurve (CC) reichte für beide Analyten von etwa 0,5 bis 250,0 ng mL−1. QC-Proben wurden bei der Quantifizierungsgrenze (LOQQC), niedrigen (LQC), mittleren (M1QC, MQC) und hohen (HQC) Konzentrationen hergestellt. Die nominale Konzentration der in Kaninchenplasma hergestellten CS- und QC-Proben ist in Tabelle 1 angegeben.

Zur Probenvorbereitung wurde die SPE-Methode zur Extraktion von VEN und ODV aus Kaninchenplasma entwickelt. Gefrorene Proben wurden bei Raumtemperatur auftauen gelassen, bevor sie zur Homogenisierung des Inhalts mit dem Vortex gemischt wurden. Zu einem 80-µL-Aliquot Kaninchenplasma in einem Polypropylenröhrchen 50 µL IS-Verdünnung (enthaltend ~ 25,0 ng mL-1 VEN-D6 und ODV-D6) und anschließend 400 µL Vorbehandlungslösung (10 % Orthophosphorsäure im Wasser) hinzufügen , v:v) wurde hinzugefügt und verwirbelt. Die Proben wurden in SPE-Kartuschen überführt (vorkonditioniert mit 0,5 ml Methanol, gefolgt von 0,5 ml Milli-Q-Wasser, und nach jeder Zugabe eine Minute lang bei 2000 rcf zentrifugiert) und eine Minute lang bei der gleichen rcf wie bei der Vorkonditionierung zentrifugiert. Die Kartuschen wurden mit 1 ml Waschlösung (5 % Ammoniaklösung in Wasser, v:v) und Milli-Q-Wasser gewaschen, indem nach jeder Zugabe eine Minute lang eine Zentrifuge bei 2000 rcf betrieben wurde. Die Proben wurden mit 1 ml Methanol durch einminütiges Zentrifugieren bei 2000 rcf eluiert und unter Stickstoffdampf bei 50 ± 4 °C und etwa 20 ± 5 psi getrocknet. Die getrockneten Probenreste wurden in 300 µL mobiler Phase rekonstituiert, verwirbelt und ein Aliquot der resultierenden Probe zur Analyse in das LC-MS/MS-System injiziert.

Für die LC wurde ein Shimadzu Nexera Die chromatographische Trennung wurde durch isokratische Elution der mobilen Phase (60 % Methanol in 2 mM Ammoniumformiatpuffer (v:v) + 0,1 % Ameisensäure L−1) bei einer Flussrate von 0,300 ml/min auf einem ACQUITY UPLC BEH C18 erreicht Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) mit einer Gesamtlaufzeit von 3 Minuten. Für jede Analyse wurde ein Injektionsvolumen von 5 µL verwendet. Die Retentionszeit für die Analyten und ihre jeweiligen stabil isotopenmarkierten internen Standards (SIL-IS) ist in Tabelle 2 angegeben. Die Temperatur des Autosamplers und des Säulenofens wurde auf 10 ± 1,0 °C bzw. 40 ± 1,0 °C eingestellt. Die Zusammensetzung der verwendeten Spüllösung war 90 % Acetonitril in Wasser (v:v).

Die eluierten Proben aus der LC wurden anschließend mit einem AB SCIEX Triple Quadrupol (QqQ) API 4000 LC/MS/MS-System analysiert, das im Multiple-Reaction-Monitoring-Modus (MRM) betrieben wurde. Die verwendete Ionenquelle war TURBO ION SPRAY, eine Elektrospray-Ionisationssonde (ESI) mit positiver Polarität. Zwei MRM-Übergänge, Q1 (Vorläuferion) und Q3 (Produktionion), mit einer Verweilzeit von 200 ms zur gleichzeitigen Quantifizierung und Identifizierung der Analyten (VEN und ODV) und ihrer SIL-IS (VEN-D6 und ODV-D6) Basierend auf der Berechnung des Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) und verbindungsabhängigen Parametern wurden optimiert.

LC/MS/MS-Daten wurden mit der ANALYST-Software Version 1.6.3 von AB SCIEX verarbeitet. Der CC wurde durch eine gewichtete (X−1, X−2 und keine, wobei X = Konzentration) lineare Regression generiert und Werte für Steigung, Achsenabschnitt und Korrelationskoeffizient (R) erhalten. Die Konzentration von VEN und ODV wurde durch Auftragen des Peakflächenverhältnisses von Analyt/IS basierend auf CC bestimmt. Mittelwert, Standardabweichung (SD), Präzision (%CV) und Genauigkeit (%Nominal) wurden mit der MS-Excel-Software berechnet.

Die entwickelte Methode wurde im Einklang mit der US FDA Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 200146, der US FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry 201847 und der US FDA ICH Harmonized Guideline M10 Bioanalytical Method Validation (2018)48 validiert. Die Validierung erfolgte im Hinblick auf die Linearität von CC, die Empfindlichkeit bei LOQ, die Selektivität, den Matrixeffekt, die Verschleppung, die Präzision und Richtigkeit (PA), die Wiederfindung und die anfallende erneute Probenanalyse (ISR) gemäß den FDA-Empfehlungen und Akzeptanzkriterien für die Bioanalytik Methodenvalidierung.

Zur Herstellung der VEN ER-Tabletten mit einem Gewicht von 140,0 mg und einer Härte von etwa 4–5 kPa wurde die Direktpressmethode unter Verwendung einer Rotationstablettenpresse mit 7,25 mm rundem konkaven Werkzeug verwendet. In-vitro-Auflösungstests wurden gemäß USP 35 „Auflösungsverfahren“ < 711 > unter Verwendung der USP-Gerätemethode (Paddel) bei 50 U/min in 900 ml Auflösungsmedium bei 37 °C durchgeführt. Die entnommenen Lösungsproben wurden spektrophotometrisch bei 225 nm unter Verwendung einer Küvette mit 5 mm Schichtdicke analysiert.

Die entwickelte bioanalytische Methode wurde zur gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und ODV in Kaninchenplasma verwendet und zur Durchführung präklinischer PK-Studien an weißen Neuseeland-Kaninchen eingesetzt. Die Tierversuche wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) der Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften der Universität Kaschmir genehmigt [Ref. Nr. F(IAEC-Approval)KU/2017/09]. Die Tierversuche wurden gemäß den relevanten indischen Gesetzen [The Breeding and Experiments on Animals (Control and Supervision) Rules 1998, Amendment Rules 2001 und Amendment Rules 2006] und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Vier Paare (männlich/weiblich) gesunder Kaninchen mit einem Gewicht von jeweils 3–4 kg wurden von der Government Rabbit Farm, Wussan (Pattan), Kaschmir, zur Verfügung gestellt. Die Kaninchen wurden in eine Referenzgruppe und eine Testgruppe aufgeteilt. Jedes der 4 Kaninchen in der Referenzgruppe erhielt eine Kapsel Efexor XR 37,5 mg oral und auf die gleiche Weise erhielten Kaninchen in der Testgruppe eine selbst hergestellte VEN ER-Tablette. Nach der Verabreichung wurden 2 ml Blut aus der Randohrvene nach 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 und 36 Stunden in Natriumheparin mit BD VACUTAINER gesammelt. Das zellfreie Plasma aus antikoaguliertem Blut wurde durch 15-minütiges Zentrifugieren der Blutproben bei 3000 rcf und 17 °C gemäß den Richtlinien der WHO zur Verwendung von Antikoagulanzien in diagnostischen Laboruntersuchungen von 200249 gewonnen. Die resultierenden Plasmaproben wurden bis zur weiteren Analyse bei –40 °C eingefroren.

Während der Methodenentwicklung wurde festgestellt, dass SPE selektiver bei der Entfernung von Störungen wie gelösten Salzen (Elektrolyten) und Proteinen aus dem Plasma ist. Die Zuverlässigkeit der Methode wurde anhand der Ergebnisse des Rückgewinnungsexperiments ermittelt, die eine hervorragende Reproduzierbarkeit lieferten. Die Anforderung eines 80-µL-Aliquots Kaninchenplasma sorgte außerdem dafür, dass weniger Probe verschwendet wurde. Für die primäre Extraktion von Analyten mit Log P > 1,5 und einem pKa von 6–10 wurde eine nichtionische und unpolare Grundlastmethode ausgewählt, und zu diesem Zweck wurden SPE-Kartuschen mit hydrophilem, unpolarem Styrol-Divinylbenzol-Polymersorbens verwendet. Die Konditionierung des Sorptionsmittels wurde mit 100 % Methanol erreicht, gefolgt von der Äquilibrierung mit 100 % Wasser. Die saure Behandlung des Plasmas mit Orthophosphorsäure half bei der Proteinfällung und machte das Plasma für die Extraktionsbeladung bereit. Während des Ladens ermöglichte der Polaritätsgradient auf der hydrophilen Sorbensoberfläche den Phasentransfer der Analyten in den hydrophoberen Polymerkern zur Retention vor dem Waschen und der anschließenden Elution. Die großen endogenen Matrixkomponenten erreichten den Kern nicht, da sie sich nicht an die Polymeroberfläche binden konnten. Durch die Waschbehandlung mit flüssigem Ammoniak wurden die Störungen entfernt, ohne dass Analyten ausgelaugt wurden. Der saubere Extrakt mit hoher Ausbeute wurde durch Elution der Plasmaprobe mit 100 % Methanol erhalten.

Der Fokus bei der LC lag darauf, scharfe Peaks mit hoher Auflösung für die untersuchten Analyten zu erhalten und eine hohe Effizienz bei maximaler MS/MS-Empfindlichkeit zu erreichen. Die chromatographische Trennung wurde isokratisch mittels Reversed-Phase-LC (RPLC) realisiert. Gemäß der grundlegenden Auflösungsgleichung für isokratische Trennungen hängt die Auflösung von der Säuleneffizienz ab, die wiederum von der Partikelgröße der stationären Phase beeinflusst wird. Da die kleineren Partikel (unter 2 µm) eine höhere chromatographische Auflösung bieten, wurde die UPLC BEH C18-Säule für die RPLC ausgewählt. Die stationäre gebundene Phase dieser Säule enthält hocheffiziente 1,7 µM Ethylen-verbrückte Ethyl-Siloxan/Silica-Hybrid-Partikel (BEH), die mit hydrophoben trifunktionellen C18-Liganden unter Verwendung proprietärer Endcapping-Verfahren gebunden sind. Die gebundene Phase hat eine Ligandendichte von 3,1 µMol M−2 und eine Kohlenstoffbeladung von 18 %. Da die Retention in der RPLC in erster Linie mit der Hydrophobie des gelösten Stoffes zusammenhängt, sollte für die Trennung des hydrophoberen Moleküls der weniger hydrophobe Ligand verwendet werden. Da VEN und ODV hoch hydrophile Moleküle sind, konnten stark hydrophobe trifunktionelle C18-Liganden eine ausreichende Bindung für die gewünschte Trennung bereitstellen. Die richtige Einstellung der Polarität der mobilen Phase ist ebenso wichtig wie die Auswahl der unpolaren Säule für die Trennung gelöster Moleküle in der RPLC. Das überwiegend polare Lösungsmittel Methanol wurde als mobile Phase optimiert und die ausreichende Pufferkapazität der mobilen Phase wurde mit Ammoniumformiat (pKa = 3,75 und Pufferbereich von 3,76–5,76) aufrechterhalten. Da die Flussrate der mobilen Phase eine wichtige Rolle bei der Auflösung kleiner Moleküle bei Umkehrphasentrennungen spielt, half die Einstellung auf 0,300 ml/min dabei, eine hohe Auflösung der Analyten zu erzielen.

Die beiden Hauptziele, die bei der Optimierung der MS/MS-Bedingungen berücksichtigt wurden, waren das Erreichen einer angemessenen Empfindlichkeit und Selektivität. Obwohl Probenextraktion, Chromatographieentwicklung und anfängliche MS-Abstimmung alle Auswirkungen auf Empfindlichkeit und Selektivität haben, hat die MS-Optimierung erheblichen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Methode. Bei der anfänglichen MS-Abstimmung bestand der erste Schritt darin, die Ionisierung der Analyten zu bestimmen. Die Ionisationsquellen-/Gasparameter (Tabelle 3) wie Gasfluss und Ionisationsspannung wurden auf die Analyten abgestimmt, um optimale Ionisationsbedingungen für den Analyten und damit eine optimale Empfindlichkeit zu erzielen. Während dieser anfänglichen MS-Abstimmung wurde der positive Ionisationsmodus für die Durchführung der MS/MS-Analyse bestimmt. Der geeignete Ionisationsmodus und die geeignete Detektionspolarität wurden basierend auf der Polarität des Analyten und den LC-Betriebsbedingungen ausgewählt. Die größte Verbesserung, die der Einsatz von ESI bietet, ist die Bildung protonierter oder deprotonierter Moleküle mit geringer Fragmentierung, was ideal für die Auswahl von Vorläuferionen einschließlich der Maximierung der Empfindlichkeit ist.

Die Tandem-Massenspektrometrie basiert im Wesentlichen auf der Auswahl der Vorläuferionen (Q1), ihrer Fragmentierung hauptsächlich durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) und der m/z-Messung der gebildeten Produkt-Ionen (Q3). Das Screening von zwei bis drei MRM-Übergängen für jeden Analyten gibt zu Beginn die Gewissheit, dass der richtige Analyt überwacht wird, und diese Selektivität hilft in späteren Phasen der Methodenentwicklung, wenn tatsächliche biologische Proben analysiert werden. Die optimierten MS-Parameter für jede Verbindung sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Analyten wurden durch kollisionsinduziertes MS/MS unter Verwendung von MRM und Massenübergangs-Ionenpaaren (Vorläufer-Produktion-Ionen-Übergänge) für VEN, VEN-D6, ODV und ODV nachgewiesen -D6 wurde als m/z 278,2 → 58,1, m/z 284,2 → 64,1, m/z 264,0 → 58,1 bzw. m/z 270,0 → 64,1 ausgewählt. Die MRM-Massenspektren und die Fragmentierung der Analyten und SIL-ISs sind in den Abbildungen dargestellt. 2, 3, 4 und 5.

MRM-Massenspektren und Fragmentierung von Venlafaxin.

MRM-Massenspektren und Fragmentierung von Venlafaxin-D6.

MRM-Massenspektren und Fragmentierung von O-Desmethylvenlafaxin.

MRM-Massenspektren und Fragmentierung von O-Desmethylvenlafaxin-D6.

Die auf MRM-MS-Spektrometrie basierende bioanalytische Methodenentwicklung in Verbindung mit der Quantifizierungsgenauigkeit durch die Verwendung von SIL-IS verbesserte die Empfindlichkeit und Selektivität durch Variabilitätskontrolle bei der Quantifizierung der Analyten und half auch bei der gleichzeitigen Überwachung der Massen des Lichts und schwere Vorläuferionen. Das MRM unterscheidet Verbindungen anhand ihrer Masse, wodurch die Notwendigkeit entfällt, jede einzelne in der Probe vorhandene Komponente durch die verwendete chromatographische Methode zu trennen. Daher bot die MRM-MS-Spektrometrie auf der QqQ-MS-Plattform die Geschwindigkeit und Genauigkeit zur Erkennung mehrerer Übergänge (Q1/Q3-Paare), was eine schnelle LC-Analyse und eine kürzere Probenvorbereitungszeit ermöglichte. Darüber hinaus ermöglichte die MRM-MS-basierte gleichzeitige Quantifizierung von VEN und seinem aktiven Metaboliten die Entwicklung einer bioanalytischen Methode mit hohem Durchsatz, die in der Lage ist, beide Formen im selben Lauf zu injizieren und so die probenspezifischen Empfindlichkeitsschwankungen von Lauf zu Lauf zu harmonisieren Ionenunterdrückung und Abweichungen in der Retentionszeit. Die Verwendung von MRM mit SIL-IS, das auch als Goldstandard der MS-Quantifizierung gilt, sorgte für Konsistenz in der Präzision und Reproduzierbarkeit der entwickelten bioanalytischen Methode. Die Reproduzierbarkeit der entwickelten MRM-MS-Spektrometriemethode erwies sich als zuverlässig, wie die Ergebnisse der ISR-Bewertung belegen. Die ISR-Daten zeigten, dass der erneut analysierte Quantifizierungswert von VEN und ODV bei 93,35 % bzw. 86,96 % der Gesamtzahl der erneut analysierten Proben ± 20 % des Mittelwerts betrug.

Alle Leer-, CS- und QC-Proben wurden im Plasma hergestellt, das von denselben Kaninchen wie die Studienproben stammte. Drei Chargen aufgestockter Plasmaproben mit acht CS-Werten ungleich Null, einschließlich einer LOQ, die den gesamten Quantifizierungsbereich abdeckten, wurden auf die Linearität von CC untersucht. Jeder Lauf umfasste außerdem zwei Replikate von jedem LQC, M1QC, MQC und HQC. Alle CS-Werte ungleich Null lagen bei ± 15 % der Nominalkonzentrationen gemäß den FDA-Akzeptanzkriterien. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrations-Reaktions-Beziehung mit dem einfachsten Regressionsmodell übereinstimmt und den linearen Charakter von CC zeigt. Die durchschnittlichen CC-Parameter für jeden Analyten sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Der niedrigste CS-Wert ungleich Null auf dem CC definiert den LOQ. Die FDA-Akzeptanzkriterien erfordern, dass die LOQ ≥ dem 5-fachen der Analytreaktion des Null-CS-Gehalts (Blindwert) entspricht, mit einer Genauigkeit von ± 20 % der Nennkonzentration und reproduzierbar mit einer Präzision von ± 20 % (%CV). Die Empfindlichkeit bei LOQ wurde als Teil der PA-Bewertung für den CC-Bereich durchgeführt und durch Ausführen des LOQQC (Abb. 6) in 6 Replikaten in drei PA-Chargen innerhalb eines Tages bestimmt. Die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die LOQ quantitativ innerhalb der akzeptablen Präzisions- und Genauigkeitskriterien bestimmt wurde.

Repräsentatives Chromatogramm der LOQQC von (a) Venlafaxin und (b) O-Desmethylvenlafaxin.

In den FDA-Richtlinien wird die Durchführung einer Selektivität während der Validierung gefordert, um Störungen durch potenziell störende endogene Komponenten der Matrix zu verringern oder zu vermeiden und um sicherzustellen, dass es sich bei der zu messenden Substanz um den beabsichtigten Analyten handelt. Die Selektivität wurde durch die Analyse von 10 Leerproben von Kaninchenplasma (Doppelleerprobe) und der Peakflächenreaktion bei Retentionszeiten von Analyten (VEN und ODV) und ISs (VEN-D6 und ODV-D6) sowohl in der Leermatrix als auch in der extrahierten LOQ nachgewiesen gemessen wurde (Abb. 7). Die verwendete Extraktionsmethode war die gleiche wie in der Probenvorbereitung „Probenvorbereitung“ erwähnt. Die prozentuale Fläche der Blindmatrix zur mittleren Peakflächenreaktion des Analyten im extrahierten LOQ für VEN und ODV betrug 1,25–4,22 % bzw. 1,07–9,22 %. Für beide ISs, VEN-D6 und ODV-D6, betrug der %-Bereich der leeren Matrix zur mittleren Peakflächen-Reaktion von IS im extrahierten LOQ 0,00–0,02 %. Die Ergebnisse lagen deutlich innerhalb der FDA-Akzeptanzkriterien und zeigten, dass die Leerproben frei von Interferenzen für den Analyten waren (< 20 % Peakflächenreaktion des Analyten in der Leerprobe im Vergleich zu extrahierten LOQ-Proben) und dass die IS-Reaktion in der Leerprobe 5 % des Wertes nicht überschritt durchschnittliche IS-Antworten von CSs und QCs.

Repräsentatives Chromatogramm der Doppelblindprobe von (a) Venlafaxin und (b) O-Desmethylvenlafaxin.

Die FDA-Empfehlungen verlangen, dass die Matrixproben auf Matrixeffekte getestet werden, damit die Präzision, Selektivität und Empfindlichkeit während der Anwendung einer LC-MS- und LC-MS/MS-Methode nicht beeinträchtigt werden. Der Matrixeffekt wird als Verschiebung einer Analytreaktion beobachtet, die normalerweise auf das Vorhandensein einer oder mehrerer unbekannter und störender Komponenten in der Probenmatrix zurückzuführen ist. Der Matrixeffekt, quantitativ anhand des Matrixfaktors (MF) gemessen, wurde als Verhältnis der Analyt-Peak-Reaktion auf LQC- und HQC-Ebene (Abb. 8, 9) in Gegenwart (extrahiert und nach der Extraktion versetzt) ​​geschätzt Abwesenheit von Matrixionen (reine Standardlösung). Darüber hinaus wurde die IS-normalisierte MF oder absolute MF als Verhältnis der MF eines Analyten zur MF eines IS berechnet. Da die Verwendung von SIL-IS die effektive IS-normalisierte MF-Variabilität verringert, ist es nicht erforderlich, MF oder IS-normalisierte MF in 6 Chargen unabhängiger Matrixproben zu bestimmen50. Es wurde festgestellt, dass die Variabilität der MFs, bestimmt durch den %CV (Tabelle 7), deutlich innerhalb der Akzeptanzkriterien der FDA ICH Harmonised Guideline liegt (weniger als 15 %).

Repräsentative Chromatogramme von Venlafaxin auf (a) LQC (gespickt), (b) LQC (reine Standardlösung), (c) HQC (gespickt) und (d) HQC (reine Standardlösung).

Repräsentative Chromatogramme von O-Desmethylvenlafaxin auf (a) LQC (gespickt), (b) LQC (reine Standardlösung), (c) HQC (gespickt) und (d) HQC (reine Standardlösung).

Bei einer Analysemethode kann es zu einer Verschleppung zwischen den Proben kommen, da ein Analyt aus der vorherigen Probe in eine Probe eindringt. Die FDA-Richtlinien fordern, dass die Verschleppung 20 % des LOQ nicht überschreiten sollte und fordern die Beseitigung jeglicher Verschleppung sowie die Überwachung ihrer Auswirkungen, falls vorhanden, auf die Quantifizierung der Studienproben. Die Verschleppung wurde überwacht, indem nach den hohen CS-Werten (HQC) drei leere Matrixproben (doppelte Blindprobe) injiziert wurden. Die prozentuale Fläche von 3 leeren Matrixproben zur mittleren Peakflächenreaktion des Analyten in der extrahierten LOQ für VEN und ODV betrug 5,17 %, 3,11 %, 2,43 % bzw. 2,72 %, 2,26 %, 5,98 %. In ähnlicher Weise blieb für VEN-D6 und ODV-D6 die prozentuale Fläche der Blindmatrix zur mittleren Peakflächenreaktion von IS im extrahierten LOQ im Bereich von 0,00 bis 0,02 %. Die Ergebnisse zeigen eine vernachlässigbare Verschleppung ohne Verbesserung der Peakflächenreaktion bei Retentionszeiten von Analyten und ISs, wodurch sichergestellt wird, dass die Verschleppung keinen Einfluss auf die PA der entwickelten Methode hat (Abb. 10).

Repräsentative Verschleppungschromatogramme von (a) Venlafaxin HQC, (b) nachfolgendem Venlafaxin-Doppelblindwert, (c) O-Desmethylvenlafaxin HQC und (d) nachfolgendem O-Desmethylvenlafaxin-Doppelblindwert.

Die Methodenvalidierung durch Wiegen von PA ist gemäß den FDA-Richtlinien unerlässlich, um die Methodenqualifikation für die Analyse von Studienproben zu ermitteln. Sie umfasst die Bewertung von 4 QC-Werten (LOQQC, LQC, MQC und HQC) über den gesamten Quantifizierungsbereich. Zwischen Chargen (zwischen den Tagen) und innerhalb der Chargen (intraday) wurde der PA bestimmt, indem VEN- und ODV-QC-Replikate gegen den CC an verschiedenen Tagen (n = 18) bzw. am selben Tag (n = 6) durchgeführt wurden. Für jeden Lauf wurden frisch zubereitete CSs und QCs verwendet. Es wurden mindestens drei unabhängige PA-Läufe durchgeführt, wobei in jedem Lauf ein CC enthalten war. Basierend auf der Leistung der Qualitätskontrollen in allen PA-Läufen zwischen Chargen und innerhalb der Chargen geht aus den in Tabelle 8 angegebenen Ergebnissen hervor, dass die PA der Methode deutlich innerhalb der FDA-Akzeptanzkriterien liegt (Präzision und Richtigkeit: ± 15 % der Nennkonzentrationen von). QCs mit Ausnahme von ± 20 % bei LOQQC).

Die Effizienz und Reproduzierbarkeit des bei der Methodenentwicklung verwendeten Extraktionsprozesses wird durch die Optimierung der Rückgewinnung von Analyt und IS ermittelt. Obwohl die Richtlinien der FDA besagen, dass die Wiederherstellung nicht 100 % betragen muss, wird jedoch darauf hingewiesen, dass das Ausmaß der Wiederherstellung konsistent und reproduzierbar ist. Die Wiederfindung wurde durchgeführt, indem die Analyt-Peakfläche (Anzahl) von jeweils 6 Replikaten der extrahierten QC-Proben bei LQC, MQC und HQC mit den entsprechenden Extrakten von Leerproben verglichen wurde, die nach der Extraktion mit dem Analyten versetzt wurden (was einer Wiederfindung von etwa 100 % entspricht). Die Wiederfindung von IS wurde auf ähnliche Weise anhand von 18 Replikaten extrahierter IS-Proben geschätzt. Die in Tabelle 9 aufgeführten Ergebnisse des Erholungsexperiments bestätigen die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der SPE, die bei der Methodenentwicklung zur gleichzeitigen Schätzung von VEN, ODV und ihren ISs verwendet wurde.

Mithilfe eines „Quality by Design“ (QbD)-Ansatzes wurden verschiedene freisetzungskontrollierende Polymere untersucht, um eine ER-Tablettenformulierung von VEN zu entwickeln. Die optimierte Formulierung, die unter Verwendung eines optimalen Mischungsdesigns (DOE) für die präklinische PK-Bewertung hergestellt wurde, enthielt 13,1 %, 19,25 % bzw. 36,4 % Carbopol 971P, Blanose 7HXF und Avicel 112. Die entsprechenden Mengen an Ligamed MF-2-V und Aerosil 200 wurden ebenfalls angepasst, um eine robuste Formulierung zu erhalten. Das optimale Mischungsdesign hilft bei der Anpassung des Ziels an die spezifischen Anforderungen51, die in diesem Fall darin bestand, die In-vitro-Arzneimittelfreisetzung mit der des RLD in Einklang zu bringen.

Der Vergleich des Auflösungsprofils zwischen der optimierten ER-Tablette und RLD in Acetatpuffer mit pH 4,5, Acetatpuffer mit pH 5,5 und Phosphatpuffer mit pH 6,8 wurde gemäß den US-amerikanischen FDA Guidance for Industry, Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Apministered Drug Products – General durchgeführt Überlegungen (2002)52 unter Verwendung des Ähnlichkeitsfaktors (f2) durch modellunabhängigen Ansatz53. Die Werte des Ähnlichkeitsfaktors f2 in verschiedenen Auflösungsmedien sind in Tabelle 10 aufgeführt. Die Auflösungsdaten der optimierten ER-Tablette und des RLD qualifizierten den f2-Kurvenähnlichkeitstest (Test vs. Referenz) mit einem f2-Wert zwischen 50 und 100, der Konsistenz gewährleistete In-vitro-Äquivalenz der beiden Auflösungsprofilkurven.

Die validierte LC-MS/MS-Methode wurde effizient zur gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und ODV in Kaninchenplasma nach oraler Verabreichung der optimierten ER-Tablette und RLD angewendet, wie unter Abschnitt 2.9 beschrieben. Die in Tabelle 11 zusammengefasste PK-Bewertung wurde mittels nichtkompartimenteller Analyse (NCA) mit WinNonlin 8.1 durchgeführt und die zusätzlichen statistischen Berechnungen wurden in SAS 9.4 durchgeführt. Die BE-Bewertung mittels Bioverfügbarkeitsvergleich wichtiger PK-Parameter zwischen Referenz- und Testprodukt erwies sich als ähnlich. Die in Tabelle 12 angegebene statistische Sicherheit der bioäquivalenten Ähnlichkeit wurde mithilfe einer Varianzanalyse der logarithmisch transformierten PK-Parameter (Cmax, AUClast und AUCINF_obs) des Referenz- und Testprodukts berechnet. Die Diagramme der mittleren Plasmakonzentration von VEN und ODV gegenüber der Zeit sind in Abb. 11 dargestellt. Die Plasmakonzentrationen von VEN und ODV blieben während des gesamten Probenahmezeitraums (36 Stunden) im Standardquantifizierungsbereich und über LOQ (0,5 ng mL−1). Die repräsentativen Chromatogramme von VEN und ODV Cmax der Referenz- und Testprodukte sind in Abb. 12 dargestellt.

Diagramme der mittleren Plasmakonzentration im Vergleich zur Zeit nach einer oralen Einzeldosis der Test-ER-Tablette und Efexor XR 37,5 mg bei weißen Neuseeland-Kaninchen.

Repräsentative Chromatogramme von (a) Venlafaxin-Cmax-Test, (b) Venlafaxin-Cmax-Referenz, (c) O-Desmethylvenlafaxin-Cmax-Test und (d) O-Desmethylvenlafaxin-Cmax-Referenz.

Die während der Formulierungsentwicklungsphase aus kleinen Studien mit einer begrenzten Anzahl von Tieren und Plasmaproben gewonnenen präklinischen PK-Daten können wichtige PK-Informationen über ein Arzneimittel und seine Dosierungsform liefern, um das erforderliche klinische PK-Verhalten zu erreichen. In dieser Arbeit berichten wir über präklinische BE-Bewertungsstudien von zwei ER-Formulierungen von VEN, Efexor XR, und einer selbst hergestellten VEN ER-Tablette bei weißen Kaninchen aus Neuseeland. Zu diesem Zweck wurde eine zuverlässige und schnelle SPE-basierte bioanalytische LC-MRM-MS/MS-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von VEN und ODV entwickelt und in Übereinstimmung mit den zulässigen Grenzwerten der FDA-Empfehlungen und Akzeptanzkriterien effektiv validiert.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Bilal Ahmad Zarger

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Diese Arbeit ist Teil des Forschungsprojekts zur Formulierungsentwicklung (FDR), das ursprünglich von AAF und NAKA konzipiert wurde. AF und SA bereiteten den Entwurf zur Formulierungsentwicklung vor und AAF führte die experimentellen Arbeiten durch. AAF und BKP entwarfen den LC-MS/MS-Arbeitsplan und führten ihn unter der Aufsicht von AKBAZ durch, der die technische Bewertung der erhaltenen LC-MS/MS-Daten durchführte. AAF, SNR und TUW führten Tierstudien durch. AAF und VK werteten die Tierdaten für pharmakokinetische Studien aus. AAF, SNR und NAK haben dieses Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Nisar Ahmad Khan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 04. Dezember 2021

Angenommen: 04. April 2022

Veröffentlicht: 04. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13389-6

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