Ionenpaarchromatographie

Mar 13, 2023

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Die Chromatographie geladener Analyten stellt oft eine Herausforderung dar, da diese auf den üblicherweise verwendeten Umkehrphasensäulen nicht effektiv zurückgehalten werden und im Totvolumen eluieren. Bei Säulen mit polaren oder wässrigen stationären Phasen können die Peakformen aufgrund übermäßiger Retention schlecht sein. Ionenaustauschsäulen, die geladene stationäre Phasen zur Trennung entgegengesetzt geladener Ionen verwenden, sind teuer, für eine kleine Auswahl an Analyten geeignet und haben eine begrenzte Trenneffizienz. Die Ionenpaarchromatographie (IPC) ist eine geeignete Alternative zur Chromatographie polarer oder ionischer Spezies.

Was ist Ionenpaarchromatographie?

Wie unterscheidet sich die Ionenpaar-Umkehrphasenchromatographie von anderen Arten der Ionenchromatographie?

- Rückhaltemechanismus

- Faktoren, die die Aufbewahrung beeinflussen

- Rolle des Ionenpaareffekts

- Umweltanalyse

- Pharmazeutische und Lebensmittelanalytik

- Biologische Analyse

- Metallanalyse

Abschluss

IPC ist eine Art der Ionenchromatographie, die zur Trennung hydrophiler oder geladener Analyten auf Säulen mithilfe von Umkehrphasen- oder „neutralen“ stationären Phasen verwendet wird, die keine Ladungen tragen. Dabei wird die Polarität der geladenen Analyten durch ihre Wechselwirkung mit einem Ionenpaarungsreagenz verändert, das der mobilen Phase zugesetzt wird. Diese Reagenzmoleküle tragen Ladungen, die denen der Analytionen entgegengesetzt sind, mit denen sie elektrostatische Bindungen eingehen können. Die zwischen den Analyten und den Reagenzionen gebildeten Paare verhalten sich wie neutrale, hydrophobe Einheiten, die auf C18- oder C8-Säulen getrennt werden können. IPC wird zur Trennung polarer organischer Säuren, Basen und Zwitterionen sowie anorganischer Ionen eingesetzt.

Ionenpaarungsreagenzien werden auch als Ionenpaarungsadditive oder Hetaeronen bezeichnet. Da diese Moleküle eine polare Kopfgruppe und hydrophobe Kohlenwasserstoffketten haben, ähneln sie einer Seife (Abbildung 1). Daher wurde diese Technik „Seifenchromatographie“ genannt, als sie 1973 von Göran Schill eingeführt wurde.1,2 Sie wird auch als Ionenwechselwirkungschromatographie bezeichnet, da das Reagens-Ion mit der stationären Phase interagiert, um die Retention der in der Probe vorhandenen Ionen zu regulieren .

Ionenchromatographie (IC) bezieht sich im Allgemeinen auf die Trennung von Ionen und umfasst drei verschiedene Mechanismen, nämlich Ionenaustausch, Ionenausschluss und Ionenpaarung. Wenn die Trennung durch konkurrierende Wechselwirkung zwischen den Analytionen und Eluentenionen um die entgegengesetzt geladenen Stellen auf der stationären Phase herbeigeführt wird (Abbildung 2), wird die Art der Chromatographie als Ionenaustauschchromatographie (IEX) bezeichnet.

Eine Mischung aus undissoziierten, teilweise dissoziierten und vollständig dissoziierten Analyten kann durch Ionenausschlusschromatographie (IEC) getrennt werden, bei der auch geladene stationäre Phasen verwendet werden (Abbildung 3). Die mobile Phase sammelt sich an der Oberfläche und in den Poren der stationären Phase an, was zur Bildung einer „okkludierten Phase“ führt. Die neutralen Analyten werden in der okkludierten Phase stark zurückgehalten und eluieren zuletzt von der Säule. Die teilweise dissoziierten Analyten, die eine etwas geringere Wechselwirkung mit der adsorbierten mobilen Phase haben, eluieren früher. Vollständig dissoziierte und geladene Analyten, die von den ähnlich geladenen Ionen der stationären Phase, der „Donnan-Membran“, abgestoßen werden, eluieren zunächst vollständig im Hohlraum der Säule.

Die Ionenpaar-Umkehrphasenchromatographie wird auf unpolaren „Umkehrphasen“-Säulen durch Zugabe von Ionenpaarreagenzien zur mobilen Phase durchgeführt. Beispielsweise wird Trifluoressigsäure zur Paarung mit positiv geladenen Peptiden verwendet, während Trialkylamine zur Ionenpaarung mit Anionen wie Carboxylaten oder Oligonukleotiden verwendet werden.

Mobile-Phase-Ionenchromatographie (MPIC) ist ein Begriff, der häufig im Zusammenhang mit der Trennung kleiner anorganischer Ionen durch IPC und der anschließenden Detektion durch Messung der unterdrückten Leitfähigkeit verwendet wird. Diese Technik eignet sich zur Analyse von Molekülen mit lokalisierten Ladungen.

Einige Mikroliter Probenlösung werden in eine Umkehrphasensäule injiziert. Wenn die mobile Phase, die das Ionenpaarungsreagenz enthält, durch die Säule fließt, interagieren die Analytionen mit den entgegengesetzt geladenen Reagenzionen und bilden neutrale Komplexe, die an einer unpolaren stationären Phase getrennt werden können. Die Trennung der Analyten wird durch das Ionenpaarungsreagenz, organische Modifikatoren und etwaige der mobilen Phase zugesetzte Salze gesteuert.

Ultraviolette (UV) und fluoreszenzspektroskopische Methoden sind die am häufigsten verwendeten Nachweistechniken für IPC. Über den Einsatz anderer Techniken wie Massenspektrometrie (MS) und induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS)3 wurde ebenfalls berichtet. Die Leitfähigkeitsmessung ist eine gut etablierte Methode zum Nachweis anorganischer Ionen mittels IC, wird jedoch für IPC weniger häufig verwendet.4

Zur Erklärung des beim IPC beobachteten Trennungsmechanismus wurden verschiedene Modelle vorgeschlagen.5 Im Ionenpaarungsmodell, auch Partitionsmodell genannt, wird davon ausgegangen, dass die Wechselwirkung zwischen den Analytionen und den Ionenpaarungsreagenzionen in der mobilen Phase stattfindet. Die Analytionen bilden zusammen mit den Gegenionen eine unpolare Einheit, die an der hydrophoben stationären Phase adsorbieren kann. Der Ionenpaarkomplex wird anschließend durch Erhöhen der Konzentration des organischen Modifikators in der mobilen Phase eluiert (Abbildung 5).

Das Ionenaustauschmodell, auch Adsorptionsmodell genannt, beinhaltet die Adsorption der lipophilen Alkylkette der Ionenpaarungsreagenzmoleküle an der stationären Phase. Die freien polaren Kopfgruppen der adsorbierten Moleküle wirken als Pseudoionenaustauscher für die entgegengesetzt geladenen Analytionen (Abbildung 6).

Im Ionenwechselwirkungsmodell, auch elektrostatisches Modell genannt, wird angenommen, dass eine elektrische Doppelschicht entsteht, wenn eine Säule mit der mobilen Phase, die ein Ionenpaarmittel enthält, ins Gleichgewicht gebracht wird. Die unpolare Kohlenwasserstoffkette dieser Einheiten bindet an die Säule. Die polaren Kopfgruppen bilden eine stationäre Ladungsschicht, während die Gegenionen des Ionenpaarungsreagenzes in der mobilen Phase die entgegengesetzt geladene Schicht bilden. Die Analytionen erfahren eine elektrostatische Anziehung zu den stationären Ladungen und können die Doppelschicht durchdringen. Die Coulomb-Wechselwirkung zwischen einem Analytmolekül und der „geladenen“ Schicht führt zu einer scheinbaren Abnahme der Ladung auf der Oberfläche der stationären Phase. Folglich wird ein Molekül des Ionenpaarmittels an der Oberfläche der stationären Phase adsorbiert, um die Ladung wiederherzustellen. Zusammengenommen kann dies als Adsorption zweier entgegengesetzter Ladungen – der des Analyten und der des Ionenpaarmittels – an der stationären Phase betrachtet werden.

Abbildung 7: Das Ionenwechselwirkungsmodell für die IPC-Trennung, das die dynamische Wechselwirkung zwischen dem Analytion, den Ionenpaarungsreagenzionen und der stationären Phase zeigt. A) Das Ionenpaarungsreagenz bindet an die stationäre Phase. B) Analytionen durchdringen die Doppelschicht. C) Analytionen binden an die polare Kopfgruppe. D) Ein neues Ionenpaarungsreagenzmolekül bindet an die stationäre Phase.

Bei der IPC können mehrere Parameter geändert werden, um die gewünschte Trennung zu erreichen. Betrachten wir einige der Variablen, die die Analytretention beeinflussen.

Wenn einem Lösungsmittel Elektrolyte zugesetzt werden, zerfallen sie in ihre Ionenbestandteile und werden von den Lösungsmittelmolekülen umgeben. Wenn jedoch die Polarität des Lösungsmittels abnimmt, nimmt die Solvatisierung der Ionen ab und aufgrund der elektrostatischen Anziehung nimmt die Wechselwirkung zwischen ihnen zu. Mit zunehmender Größe der Ionen nimmt die Ladungsdichte ab, was auch zu einer geringeren Solvatation und einer stärkeren Wechselwirkung mit den entgegengesetzt geladenen Ionen führt. Je größer die Ladung der Ionen ist, desto stärker ist die Coulomb-Anziehungskraft zwischen den entgegengesetzt geladenen Ionen.

Ionenpaarungsreagenzien haben lange Alkylketten oder Arylgruppen und sind nicht so solvatisiert wie kleine Ionen mit hohen Ladungsdichten. Dadurch können sie entgegengesetzt geladene Analytionen anziehen und sich mit ihnen paaren. Wenn außerdem Ionenpaarungsreagenzien an der unpolaren stationären Phase adsorbiert werden, wird deren Solvatation weiter verringert. Dadurch können sie mit Analytmolekülen „enge“ oder „innige“ Ionenpaare bilden. Bei diesen Ionenpaaren befinden sich zwischen den beiden Ionen keine Lösungsmittelmoleküle. Je größer die Ladung des Analyten und der Reagenzionen ist, desto stärker ist die Bindung zwischen ihnen.

Die Wahl des Ionenpaarungsreagenzes ist möglicherweise der wichtigste Parameter bei der Verwendung von IPC. Der Reagenztyp, seine Konzentration und Kompatibilität mit der mobilen Phase und dem Detektor spielen alle eine wichtige Rolle für die effektive Trennung der Analyten. Bei der Auswahl eines Ionenpaarungsreagenzes für die zu untersuchende Probe müssen die folgenden Überlegungen berücksichtigt werden.

Obwohl die Ionenpaarchromatographie bestimmte Vorteile gegenüber anderen Techniken wie IEX und Normalphasenchromatographie bietet, weist sie auch Einschränkungen auf (Tabelle 1). Diese Vor- und Nachteile müssen sorgfältig abgewogen werden, bevor man sich für diese Art der Trennung entscheidet.

Tabelle 1: Stärken und Grenzen von IPC.

Stärken

Einschränkungen

Die Analyse einer Mischung aus polaren, unpolaren und ionischen Verbindungen, die mit anderen Techniken nur schwer zu trennen sind, kann durch die Auswahl eines geeigneten Ionenpaarungsreagenzes und die Anpassung seiner Konzentration erreicht werden

Es sind lange Äquilibrierungszeiten erforderlich, damit das Ionenpaarungsreagenz an der Oberfläche der stationären Phase adsorbiert

IPC kann auf C18- oder C8-Säulen durchgeführt werden, die in den meisten Labors allgemein verfügbar sind

Die Gradientenanalyse kann für IPC schwierig sein, da Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phase zu einer längeren Säulenäquilibrierung führen können

Sowohl Kationen als auch Anionen können mit derselben Säule getrennt werden

Das Ionenpaarungsreagenz sollte keine Wellenlängen absorbieren, in denen die UV- oder Fluoreszenzdetektion durchgeführt wird. Das Vorhandensein lichtabsorbierender Reagenzien in der mobilen Phase kann aufgrund der geringeren Absorption des Analyten im Vergleich zu der mobilen Phase, die das Ionenpaarungsreagenz enthält, Geisterpeaks und negative Peaks verursachen

Ionenpaarungsreagenzien helfen, Retention, Peakformen und Auflösung zu verbessern

Häufig verwendete Ionenpaarmittel mit begrenzter Flüchtigkeit sind nur begrenzt mit Massenspektrometern kompatibel. Wenn TFA als Modifikator verwendet wird, führt es zu einer Signalunterdrückung in Massenspektrometern

In Gegenwart von Ionenpaarungsreagenzien können kürzere Laufzeiten und Nachweisgrenzen erzielt werden

Bei der Arbeit mit IPC-Reagenzien müssen möglicherweise spezielle Säulen verwendet werden

IPC wurde für die Analyse einer Vielzahl von Analyten eingesetzt, von Umweltproben, Pharmazeutika und Lebensmitteln bis hin zu biologischen Proben und Metallen.

Für die Trennung geladener und polarisierbarer Moleküle wurden verschiedene Chromatographiemodi wie die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) und IEX sowie verschiedene Arten stationärer Phasen wie Ionenaustausch- oder Polarphasen verwendet. Dennoch wird IPC aufgrund seiner Einfachheit und Anpassbarkeit weiterhin für ihre Analyse verwendet. Parameter wie die Wahl des Ionenpaarungsreagenzes, seine Konzentration, organische Modifikatoren und Zusätze für die mobile Phase können optimiert werden, um die gewünschte Trennung zu erreichen.

Verweise

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