Anwendung von Qualität

Jan 15, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8559 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hierin wurde eine empfindliche und selektive spektrofluorimetrische Methode zur Bestimmung des Augenlokalanästhetikums Benoxinathydrochlorid (BEN-HCl) in Augentropfen und künstlichem Kammerwasser entwickelt. Die vorgeschlagene Methode basiert auf der Wechselwirkung von Fluorescamin mit der primären Aminogruppe von BEN-HCl bei Raumtemperatur. Nach der Anregung des Reaktionsprodukts bei 393 nm wurde die emittierte relative Fluoreszenzintensität (RFI) bei 483 nm gemessen. Die wichtigsten experimentellen Parameter wurden sorgfältig untersucht und mithilfe eines analytischen Quality-by-Design-Ansatzes optimiert. Die Methode nutzte einen zweistufigen vollfaktoriellen Entwurf (24 FFD), um den optimalen RFI des Reaktionsprodukts zu erhalten. Die Kalibrierungskurve war im Bereich von 0,10–1,0 μg/ml BEN-HCl linear mit einer Empfindlichkeit bis hinunter zu 0,015 μg/ml. Die Methode wurde zur Analyse der BEN-HCl-Augentropfen angewendet und konnte auch deren Spitzenwerte im künstlichen Kammerwasser mit hohen prozentualen Wiederfindungen (98,74–101,37 %) und niedrigen SD-Werten (≤ 1,11) bestimmen. Um das Umweltprofil der vorgeschlagenen Methode zu untersuchen, wurde eine Umweltbewertung mit Hilfe des Analytical Eco-Scale Assessment (ESA) und GAPI durchgeführt. Die entwickelte Methode erhielt ein sehr hohes ESA-Rating und war darüber hinaus empfindlich, erschwinglich und ökologisch nachhaltig. Die vorgeschlagene Methode wurde gemäß den ICH-Richtlinien validiert.

Benoxinathydrochlorid (BEN-HCl), ein para-Aminobenzoesäureester von 2-Diethylaminoethyl-4-amino-3-butoxybenzoat1, wird als Hydrochloridsalz in einer 0,4 %igen Lösung bei kurzen ophthalmologischen Eingriffen2 verwendet. Die Reinheit von BEN-HCl betrug 99,80 ± 0,6 %3. Die Arzneibücher der Vereinigten Staaten, Europas und Japans führen es alle als offizielles Medikament auf, wenn es als Lokalanästhetikum auf die Bindehaut verabreicht wird und weniger Reizungen verursacht als sein Analogon Tetracain3,4,5. Sein analytisches Profil umfasste verschiedene Techniken, darunter spektrophotometrische6,7,8, elektrochemische9 und chromatographische (HPLC und GC)7,10,11 Methoden. Allerdings werden HPLC und GC aufgrund der hohen Gerätekosten und der übermäßigen Menge an Lösungsmitteln nicht häufig in allen Labors eingesetzt; Daher sind andere einfache, schnelle und wirtschaftliche Ansätze wie die Spektroskopie erforderlich.

Im Bereich der Materialwissenschaften hat sich eine mögliche Analysemethode, nämlich die Spektrofluorimetrie, zu einer gemeinsamen Grundlage für viele empfindliche Bestimmungen entwickelt12,13,14,15. Aufgrund ihrer intrinsischen Empfindlichkeit, Schnelligkeit und ihres breiten linearen Nachweisbereichs ist die Spektrofluorimetrie für die Routineanalyse und -überwachung wünschenswert16. In diesem Manuskript haben wir eine Methode zur Bestimmung von BEN-HCl vorgeschlagen, die auf der Wechselwirkung von Fluorescamin mit der primären Aminogruppe von BEN-HCl bei einem leicht alkalischen pH-Wert bei Raumtemperatur basiert, wodurch eine stark fluoreszierende Verbindung entsteht. Die Vorteile der Verwendung von Fluorescamin als Aminogruppen-derivatisierendes fluorogenes Reagens waren der Grund für seine Verwendung im vorgeschlagenen Verfahren. Fluorescamin hat gegenüber anderen fluorogenen Verbindungen mehrere Vorteile, darunter Einfachheit, Geschwindigkeit und das Fehlen einer Erwärmung. Obwohl das Fluorescamin-Reagens allein unglaublich schwach fluoresziert, erzeugt es ein stark fluoreszierendes Reaktionsprodukt (Pyrrolon-Kation), wenn es mit einer Aminogruppe reagiert17. Diese Reaktion ist pH-abhängig und in einem leicht alkalischen Medium extrem leuchtend, da das Pyrrolon-Kation ungesättigt, konjugiert, planar und starr in der Struktur ist. In einem sauren oder stark alkalischen Medium entsteht ein weiteres nichtplanares und weniger konjugiertes Derivat.

Eines der Hauptziele analytischer Labore besteht derzeit darin, die Entwicklung der grünen analytischen Chemie (GAC) voranzutreiben. Die zwölf Grundregeln des GAC sind die Prinzipien, auf denen alle Instrumente zur Bewertung der Umweltfreundlichkeit basieren18,19,20. Das Hauptziel von GAC besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen der Reduzierung der mit den Analysemethoden verbundenen Umweltrisiken und der Wiederherstellung der hohen Qualität seiner Ergebnisse zu finden. Allerdings müssen Umweltgefahren wie schädliche Chemikalien und/oder Lösungsmittel, energieverschwendende Maschinen, die Einführung großer Mengen giftiger Abfälle oder erwartete Risiken für die Umwelt und die menschliche Gesundheit21,22 gründlich bewertet werden. Für diese Bewertung wurden viele Bewertungsinstrumente entwickelt23. Zur Bewertung des Umweltprofils der vorgeschlagenen Methode wurden die Analytical Eco-Scale-Bewertung (ESA) und der Green Analytical Procedure Index (GAPI)24,25 herangezogen, die sich als ausgezeichnet umweltfreundlich erwiesen.

Darüber hinaus nutzt das Quality-by-Design (QbD)-Modell eine statistikbasierte Strategie, die viele Vorteile für den Entwurf, die Änderung und die Validierung der entwickelten Methode bietet26,27. Im Vergleich zu univariaten Verfahren erfordert die Optimierung deutlich weniger Aufwand, Zeit und Ressourcen. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung experimenteller Designs durch die genaue Bestimmung wesentlicher Methodenvariablen und die Bereitstellung von Diagrammen, die die ideale Leistung und Zuverlässigkeit der Methode zeigen, eine bessere Verbesserung und ein besseres Verständnis der Leistung der entwickelten Methode28. Die Attraktivität von QbDs ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, im Gegensatz zu den univariaten Techniken die kritischsten Faktoren zu identifizieren, sie zu kategorisieren und ihre Beziehungen zu analysieren. Die Wahl eines zweistufigen vollfaktoriellen Designs (24 FFD) für diese Untersuchung wurde getroffen, da es sich um eines der einfachsten Screening-Designs handelt, das das Screening vieler Variablen mit einer begrenzten Anzahl von Experimenten ermöglicht29,30.

Daher zielte die vorgeschlagene Arbeit darauf ab, mit Hilfe von QbD einen umweltfreundlichen analytischen Ansatz zu entwickeln, der zur schnellen, sicheren und wirtschaftlichen Quantifizierung von BEN-HCl in einer Vielzahl von Matrizen, einschließlich seiner reinen Form, Augentropfen und künstlichem Kammerwasser, verwendet werden könnte . Gute Selektivität, Empfindlichkeit und Einfachheit sind wichtige Merkmale der vorliegenden Methode. Die Neuheit der aktuellen Studie besteht darin, dass sie die erste Methode ist, die Fluorescamin als Aminogruppen-derivatisierendes fluoreszierendes Reagens für BEN-HCl verwendet, indem sie einen QbD-Ansatz anwendet. Diese Studie stellt eine umweltfreundliche, wirtschaftliche und einfache analytische Lösung zur Bestimmung des untersuchten Arzneimittels dar, ohne dass große Mengen organischer Lösungsmittel oder komplizierte Techniken wie HPLC oder LC-MS erforderlich sind.

Fluoreszenzspektren wurden mit einem FS5-Spektrofluorimeter (Edinburgh, UK) aufgenommen, das mit einer 150-W-Xenonlampenquelle zur Anregung und einer 1-cm-Quarzzelle ausgestattet war. Das Instrument wird von der Fluoracle®-Software begleitet. Die Geschwindigkeit betrug 1000 nm/min und die Spaltbreiten wurden mit 2,0 nm gewählt. Es wurde eine in der Schweiz hergestellte analytische Digitalwaage verwendet. Zur Messung des pH-Werts der Lösungen wurde ein pH-Meter (Modell; AD1030) von Adwa verwendet. Die statistische Auswertung des Versuchsaufbaus wurde mit der Statistiksoftware Minitab® 16 (State College, Pennsylvania) durchgeführt.

Alle Reagenzien und Chemikalien waren von analytischer Qualität. Die National Organization for Drug Control and Research (NODCAR), Gizeh, Ägypten, stellte Benoxinathydrochlorid (BEN-HCl) mit einer Reinheit von 99,80 ± 0,6 % zur Verfügung. Eine 0,4 % w/v (11,6 mM) sterile Augenlösung (BENOX®, B.-Nr. MF07) wurde in einer örtlichen Apotheke gekauft.

Durch Auflösen von 10,0 mg BEN-HCl in 100,0 ml hochreinem destilliertem Wasser wurde eine Standardlösung von BEN-HCl (0,1 mg/ml) hergestellt. Die Kalibrierungsdiagramme und Qualitätskontrollproben (QC) wurden mit dieser Lösung erstellt. Die Qualitätskontrollproben wurden in drei Konzentrationsstufen von 0,1, 0,4 und 1,0 μg/ml erzeugt und die Kalibrierungskurve wurde unter Verwendung von sechs Konzentrationsstufen im Bereich von 0,1–1,0 μg/ml erstellt. Bei Lagerung an einem kühlen und dunklen Ort erwies sich die Lösung als mindestens eine Woche lang stabil.

Der Fluorescamin-Farbstoff wurde von der Sigma-Aldrich Company (Deutschland) bezogen. Es wurde frisch in Aceton mit einer Konzentration von 0,04 % w/v hergestellt. Borsäure und Natriumhydroxid wurden zur Herstellung eines Boratpuffers (0,1 M, pH 7,5–9) verwendet. Um die chemische Zusammensetzung des menschlichen Kammerwassers nachzuahmen, wurde künstliches Kammerwasser nach der von Macri et al.31 beschriebenen Methode hergestellt.

Ein Satz kalibrierter 10-ml-Messkolben wurde mit präzisen Volumina Standard-BEN-HCl im Konzentrationsbereich von 0,10–1,0 μg/ml gefüllt. 1,5 ml Boratpuffer (0,1 M, pH 8,2) und 1,0 ml Fluorescaminlösung (0,04 %, w/v in Aceton) wurden zugegeben und gründlich gemischt. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt und dann fünf Minuten lang stehen gelassen. Die Fluoreszenz des erhaltenen Reaktionsprodukts wurde bei einer Wellenlänge von 483 nm nach Anregung bei 393 nm gemessen. Die gleiche Methodik wurde in einem Blindexperiment verwendet, jedoch ohne BEN-HCl.

Mit hochreinem destilliertem Wasser wurde ein bestimmtes Volumen der BENOX®-Augenlösung, die 20 mg BEN-HCl enthält, präzise verdünnt. Die Lösung wurde mit demselben Lösungsmittel weiter verdünnt, um eine Konzentration von 100,0 μg/ml zu erhalten. Verschiedene Proben innerhalb des linearen Bereichs wurden gemäß dem Verfahren unter „Allgemein empfohlenes Verfahren“ gemessen. Die nominalen Gehalte der ophthalmischen Lösungen wurden mithilfe der entsprechenden Regressionsgleichung berechnet.

Aliquots von künstlichem Kammerwasser wurden in einen Satz 10-ml-Messkolben (jeweils 1,0 ml) gegeben. Die quantitativen Aliquots der BEN-HCl-Arbeitslösung wurden innerhalb des Arbeitskonzentrationsbereichs zugegeben, gefolgt von einer 2-minütigen Vortexmischung. Die Kolben wurden mit destilliertem Wasser auf das Volumen aufgefüllt; Anschließend wurde die resultierende Lösung filtriert und analysiert, wie unter „Allgemein empfohlenes Verfahren“ beschrieben.

Die Selektivität, die Linearität des Kalibrierungsdiagramms, die Quantifizierungsgrenze (LOQ), die Nachweisgrenze (LOD), die Präzision, die Genauigkeit und die Wiederfindung der Methode wurden alle untersucht. Um die Selektivität zu ermitteln, wurden fünf verschiedene Standard-BEN-HCl-Proben gemessen, die dem künstlichen Kammerwasser im linearen Bereich (0,15, 0,30, 0,40, 0,60 und 0,08 µg/ml) beigemischt waren. Die Linearität der Kalibrierungskurven wurde durch die Erstellung und Analyse von Standard-BEN-HCl-Proben bekannter Konzentrationen (im Bereich von 0,10–1,0 μg/ml mit sechs Konzentrationspunkten) mit Dreifachmessungen für jede Konzentration bewertet. LOD und LOQ wurden mithilfe der folgenden Gleichungen berechnet:

Dabei ist S die Steigung der Kalibrierungskurve und σ die Standardabweichung des Achsenabschnitts.

Die Genauigkeit und Präzision wurden bewertet, indem die QC-Proben an jedem der drei Validierungstage dreimal bei jedem der drei Konzentrationsniveaus (0,20, 0,40 und 1,00 µg/ml) bestimmt wurden. %RSD wurde zur Berechnung der Präzision verwendet und ein Prozentsatz der gemessenen Konzentration gegenüber der Nennkonzentration wurde zur Berechnung der Genauigkeit verwendet. Das Kriterium zur Bestimmung, ob die Präzision angemessen war, bestand darin, dass der %RSD 15 % nicht überschritt und die Genauigkeit innerhalb von 15 % des tatsächlichen Werts lag32,33. Um die Rückgewinnung (Extraktionseffizienz) von BEN-HCl aus pharmazeutischen Präparaten und/oder künstlichem Kammerwasser zu bestimmen, wurde die Fluoreszenzintensität (FI) des extrahierten BEN-HCl mit der von reinen Standards verglichen, was einer 100-prozentigen Rückgewinnung entspricht34.

Es war notwendig, erste Experimente durchzuführen, um die Machbarkeit des Versuchsdesigns zu beurteilen. Nach der Untersuchung des Einflusses verschiedener experimenteller Bedingungen auf die Fluoreszenzintensität von BEN-HCl wurde festgestellt, dass die wichtigsten unabhängigen Faktoren der Puffer-pH-Wert, das Puffervolumen, das Fluorescamin-Volumen und die Reaktionszeit sind. Es wurden zwei Versuchssätze durchgeführt, einer bei den maximalen Werten und einer bei den niedrigeren Einstellungen, um den Bereich für jeden Faktor zu ermitteln. Der gewählte Bereich für den Puffer-pH-Wert lag bei (7,4–8,2), der für Puffer- und Fluorescamin-Volumina bei (0,5–1,5 ml) bzw. (0,5–1,0 ml) und der ausgewählte Bereich für die Reaktionszeit bei (0–5 Min.). ). 24 FFD wurde mithilfe von sechzehn geplanten Experimenten durchgeführt, um die optimalen Einstellungen zu untersuchen, die die optimalen Antwortwerte liefern (Tabelle 1).

Die bei jedem Experiment erhaltene Reaktion (RFI) wurde gemessen und in das Minitab-Programm eingegeben. Mithilfe des Antwortoptimierers wurden die Werte sowohl der zusammengesetzten (D) als auch der individuellen (d) Erwünschtheit maximiert. Anschließend wurden mithilfe des Optimierungsdiagramms die vorteilhaftesten experimentellen Parameter ermittelt, die die beste Reaktion hervorrufen (Abb. 1). Anschließend wurde die Studie unter den angenommenen Idealbedingungen durchgeführt.

24 FFD-Optimierungsdiagramme.

Der in Schema 1 dargestellte vorgeschlagene Reaktionsmechanismus veranschaulicht, wie BEN-HCl über seine primäre aliphatische Aminogruppe mit dem Reagens reagiert und die Fluoreszenz des Reagens stimuliert35,36,37,38,39. Das erhaltene Fluorophor emittiert nach seiner Anregung bei 393 nm Licht mit einer spezifischen Wellenlänge von 483 nm (Abb. 2).

Der berichtete Reaktionsmechanismus von BEN-HCl und Fluorescamin bei einem pH-Wert von 8,2.

Anregungs-/Emissionsspektren des Reaktionsprodukts von BEN-HCl (0,4 µg/ml), 0,1 M Boratpuffer (pH = 8,2, 1,5 ml) und Fluorescamin (0,04 %, w/v (14,0 µM), 1,0 ml).

Entsprechend den Vorteilen der analytischen QbD wurden die spektrofluorimetrischen Eigenschaften des fluoreszierenden Reaktionsprodukts und die experimentellen Variablen, die seine Stabilität und Intensität beeinflussen, untersucht und optimiert. Das Puffervolumen und der pH-Wert des Puffers erwiesen sich als die wichtigsten unabhängigen Variablen, während sich das Fluorescaminvolumen (0,04 %, w/v) und die Reaktionszeit als weniger kritische Faktoren erwiesen. In allen genannten Experimenten wurde BEN-HCl in einer Konzentration von 0,4 µg/ml verwendet.

Bei den Vorversuchen wurde der pH-Effekt im Bereich von 7,0–9,2 untersucht (Abb. S1) und es wurde festgestellt, dass sich die Intensität des erhaltenen Produkts nur in einem leicht alkalischen Medium entwickelt und in einem sauren Medium vollständig verschwindet die Bildung einer nichtplanaren Ableitung17. Infolgedessen wurde der pH-Wert der Studie auf den Bereich von 7,4–8,2 begrenzt, was die Auswahl des am besten geeigneten Boratpuffers35,36,37,38 ermöglichte. Als optimaler pH-Wert wurde pH 8,2 ermittelt (Abb. 1 und 3). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität mit zunehmendem pH-Wert abnahm (Abb. S1), was auf die Bildung von hydroxyliertem Pyrrolon zurückzuführen ist, das nicht planar und weniger konjugiert ist als kationisches Pyrrolon mit 3D-Strukturen40. Der Einfluss des Boratpuffervolumens auf die Fluoreszenzintensität wurde in den ersten Versuchen im Bereich von 0,5–2,0 ml untersucht (Abb. S1). Aus den erhaltenen Ergebnissen ging hervor, dass die ausgewählte Domäne für das Design 0,5–1,5 war und die maximale Reaktion mit 1,5 ml Puffer erzielt wurde (Abb. 1 und 3). Infolgedessen wurden während des gesamten Experiments 1,5 ml des vorbereiteten Boratpuffers mit einem pH-Wert von 8,2 verwendet. Darüber hinaus wurde in ersten Versuchen ein Volumen im Bereich von 0,3–1,5 Fluorescamin getestet (Abb. S1). Als Domäne für das Design wurde ein Volumen von 0,5–1,0 ml Fluorescamin (0,04 %, w/v; 14,0 µM) ausgewählt, und die maximale Produktfluoreszenz wurde mit 1,0 ml erhalten (Abb. 1 und 3). Anschließend wurden die Stabilität und Bildung des Endreaktionsprodukts in den ersten Versuchen periodisch von 0 bis 15 Minuten getestet (Abb. S1). Für das Design wurde eine Domäne im Bereich von 0–5 gewählt, und die optimale Fluoreszenzintensität wurde in etwa 5 Minuten erreicht (Abb. 1 und 3), was zeigt, wie schnell das Reaktionsprodukt produziert wird, was eine Erhöhung des Methodendurchsatzes bei der Analyse ermöglicht. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Fluoreszenz des Produkts bei Raumtemperatur mindestens 15 Minuten lang stabil ist (Abb. S1), was einen weiteren Vorteil der entwickelten Methode darstellt. Diese Eingabebereiche wurden ausgewählt, da in den ausgewählten Bereichen der signifikanteste Effekt auf die Fluoreszenzintensität des untersuchten Arzneimittels festgestellt wurde.

Oberflächendiagramme von RFI im Vergleich zu allen Paaren signifikanter unabhängiger Faktoren.

Den ersten Experimenten zufolge waren die vier unabhängigen Variablen Puffer-pH, Puffervolumen, Reaktionszeit und Fluorescaminvolumen, die den größten Einfluss auf die abhängige Reaktion (RFI) hatten. Nach der Identifizierung des Bereichs jeder Variablen, wie unter „Faktorisches Design“ im Abschnitt „Experimente“ beschrieben, wurde 24 FFD mit den sechzehn vorbereiteten Experimenten durchgeführt, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. Die Antworten aus den sechzehn Experimenten wurden dann in die Minitab-Software eingegeben, wo die Der Antwortoptimierer wurde verwendet, um die gewünschte Antwort zu maximieren (Tabelle 2). Der hohe zusammengesetzte Erwünschtheitswert (D) der vorliegenden Studie zeigt, dass die Bedingungen akzeptabel sind. Das Optimierungsdiagramm (Abb. 1) und die Erwünschtheitsanalyse wurden verwendet, um die optimalen Bedingungen wiederherzustellen, die sich als pH-Wert von 8,2, ein Puffervolumen von 1,5 ml, ein Fluorescamin-Volumen von 1 ml und eine Reaktionszeit von 5 erwiesen Mindest.

Einer der bedeutendsten Vorteile des Einsatzes von QbD ist die Fähigkeit, die wichtigsten Einflussvariablen auf die abhängige Reaktion zu erkennen und zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht es die Analyse der Wechselwirkungen dieser Variablen, was mit herkömmlichen Optimierungstechniken nicht möglich ist30. Hierzu können mehrere Minitab-Diagramme verwendet werden, darunter das Pareto-Diagramm, das Haupteffektdiagramm, das Normaldiagramm und das vollständige Interaktionsdiagramm (Abb. 4). Darüber hinaus ermöglichte die Verwendung der in Tabelle 3 dargestellten berechneten unabhängigen Variablenkoeffizienten (Daten in codierten Einheiten) die quantitative Analyse der RFI-Reaktion. Aus dem Diagramm der Haupteffekte, dem Pareto-Diagramm und dem Normaldiagramm (Abb. 4) wurde geschlossen, dass die Reaktionszeit und der pH-Wert des Puffers den größten signifikanten Einfluss auf den RFI haben. Diese Eigenschaften wirken sich den geschätzten Effektwerten zufolge günstig auf den RFI aus. Die Interaktion zwischen Puffer-pH, Puffervolumen und Reaktionszeit hat laut Interaktionsdiagramm auch den positivsten Einfluss auf den RFI. Im Gegensatz dazu zeigte das Puffervolumen den geringsten Einfluss auf RFI und den geringsten Wert unter den geschätzten Effekten (Tabelle 3). Die Bedeutung von Effekten wurde auch durch die Varianzanalyse (ANOVA) untersucht, die die Variabilität der Effekte mit einer Schätzung des experimentellen Fehlers vergleicht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

(A) 24-FFD-Pareto-Diagramm der Auswirkungen auf den RFI bei Alpha = 0,05, (B) 24-FFD-Haupteffektdiagramm für RFI nach Datenmitteltyp, (C) 24-FFD-Normaldiagramm der Auswirkungen auf den RFI bei Alpha = 0,05 , (D) 24 FFD-Vollinteraktionsdiagramme für RFI nach Datenmitteltyp.

Unter Anwendung der kontinuierlichen Variationsmethode von Job41,42 anhand molarer Konzentrationsverhältnisse (1,60 µM) wurde das Verhältnis zwischen dem untersuchten BEN-HCl und dem Fluorescamin-Reagenz berechnet. Wie beobachtet, wurde festgestellt, dass die Reaktion zwischen ihnen ein Molverhältnis von 1:1 aufwies (Abb. 5). Dieses Verhältnis steht im Einklang mit der Tatsache, dass BEN-HCl eine Aminogruppe besitzt.

Job-Methode zur kontinuierlichen Variation der Reaktion zwischen BEN-HCl und Fluorescamin (beide 1,60 µM) unter Verwendung von Boratpuffer, 0,1 M (1,5 ml, pH 8,2).

Die Gültigkeit der vorgeschlagenen Methode wurde gemäß den Q2/R1-Richtlinien des International Council on Harmonization (ICH)43 untersucht; wo der Linearitätsbereich, LOD, LOQ, Genauigkeit, Präzision, Robustheit und Selektivität festgelegt wurden. Nach Messung der Fluoreszenzintensität unter Verwendung der entsprechenden BEN-HCl-Konzentration zeigte die entwickelte Methode unter idealen Reaktionsbedingungen eine akzeptable Linearität (r2 = 0,9998) im Konzentrationsbereich von (0,10–1,0 μg/ml). Die Linearität folgte der Regressionsgleichung y = 123,55x + 288,22. Die LOD und LOQ betrugen 0,015 bzw. 0,045 μg/ml, berechnet wie im experimentellen Teil beschrieben.

Um die Genauigkeit der Methode zu bewerten, wurden drei QC-Konzentrationen von BEN-HCl (0,20, 0,40 und 1,00 µg/ml) verwendet. Bei jeder Konzentration wurden Dreifachmessungen durchgeführt. Gemäß Tabelle 5 lag der gefundene prozentuale Wiederfindungsbereich bei 97,0 bis 100,6 und die Standardabweichung lag zwischen 0,58 und 1,52, was auf die hohe Genauigkeit der Methode hinweist.

Für die vorgeschlagene Methode wurden zwei Präzisionsebenen überprüft, nämlich die Präzision zwischen und innerhalb eines Tages. Am selben Tag wurden drei Messungen mit BEN-HCl-Konzentrationen von 0,35, 0,45 und 0,55 µg/ml durchgeführt, die anderen drei Tests wurden an den folgenden zwei Tagen durchgeführt. Gemäß Tabelle 6 lagen die resultierenden %-RSD-Werte unter 2 %, was die hohe Präzision des vorgeschlagenen Ansatzes zeigt.

Die Robustheit dieser Methode wurde bewertet, indem die Auswirkung geringfügiger Variationen der experimentellen Parameter auf den RFI untersucht wurde, einschließlich pH (8,2 ± 0,2), Puffervolumen (1,5 ± 0,5 ml) und Fluorescaminvolumen (1,0 ± 0,3 ml). Die erhaltenen Werte der berechneten Konzentration wurden praktisch als % relativer Fehler (%RE) ausgedrückt. Der %RE vergleicht einen experimentellen Wert mit dem richtigen oder erwarteten Wert und drückt die Antwort als absoluten Wert eines Prozentsatzes aus. Ein %RE von 0 % bedeutet, dass der experimentelle Wert mit dem erwarteten Wert übereinstimmte, und der niedrige Wert zeigt auch die Genauigkeit der Methode an. Die beabsichtigten geringfügigen Abweichungen hatten keinen Einfluss auf den RFI und demonstrierten die Robustheit der vorgeschlagenen Methode, wie in Tabelle 7 dargestellt.

Als nächstes wurde der Matrixeffekt untersucht, wobei verschiedene versetzte Kammerwasserproben hergestellt wurden, um das Vorhandensein von Interferenzen zu testen. Die vorgeschlagene Methode zeigte hohe prozentuale Wiederfindungen (98,74–101,37 %) und niedrige SD-Werte (≤ 1,11) ohne jegliche Beeinträchtigung durch die Hilfsstoffe oder Zusatzstoffe, was den vernachlässigbaren Matrixeffekt zeigt (Tabelle 8).

Die vorgeschlagene Methode wurde erfolgreich zur Bestimmung von BEN-HCl in seinen Augentropfen (Benox®-Augentropfen) angewendet. Die durchschnittliche prozentuale Wiederfindung für die verschiedenen Konzentrationen war ausreichend und es gab keine Anzeichen einer Probenmatrixinterferenz, wie in Tabelle 9 gezeigt. Eine statistische Auswertung der Ergebnisse der vorgeschlagenen und gemeldeten Methode7 wurde durchgeführt. Bei Verwendung des Student-T- und F-Tests mit einem Konfidenzniveau von 95 % dürfen die geschätzten Werte beider Variablen nicht größer als die theoretischen Werte sein, wie in Tabelle 9 dargestellt.

Auf die vorgeschlagene Methode zur Untersuchung von BEN-HCl mit künstlichem, versetztem Kammerwasser wurde das Konzept der Festzeitmethode angewendet. Bestimmte BEN-HCl-Konzentrationen (0,15, 0,3, 0,4, 0,6, 0,8 μg/ml) im Bereich der etablierten Kalibrierungskurve (0,1–1,0 μg/ml) wurden dem vorbereiteten künstlichen Kammerwasser zugesetzt und nach Anwendung der vorgeschlagenen Methode wurde der RFI jeder Konzentration gemessen31. Es wurden hohe prozentuale Wiederfindungen im Bereich von (98,74–101,37 %) und niedrige SD-Werte (≤ 1,11) mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9998 erzielt, wie in Tabelle 8 dargestellt.

Analytical Eco-Scale Assessment (ESA) und Green Analytical Procedure Index (GAPI) sind die relativ beliebtesten Maßnahmen, da sie auf die meisten Analysetechniken anwendbar sind. In der aktuellen Untersuchung wurden diese Bewertungsinstrumente verwendet, um das Grünprofil der entwickelten Methode zu bewerten.

Die analytische ESA, die in erster Linie zur Quantifizierung der umweltfreundlichen Parameter einer Methode entwickelt wurde, ist das nützlichste Bewertungsinstrument44. Dies hängt von den Berechnungen ab, die zur Messung der Strafpunkte verwendet werden, die für die entwickelte Methode basierend auf den Arten der verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel, potenziellen Gefahren am Arbeitsplatz, der während des Prozesses verbrauchten Energiemenge und der Menge des produzierten Abfalls vergeben wurden. Eine Zahl (als Ergebnis der ESA) wird ermittelt, indem die für die Methode insgesamt vergebenen Strafpunkte von einem Bewertungsergebnis von 100 abgezogen werden.

Die getestete Analysemethode wird umweltfreundlicher, je näher sie 100 kommt. Die Ergebnisse der vorgeschlagenen Methode zeigten einen hervorragenden Wert von 89, wenn sie auf Augentropfen angewendet wurden, die BEN-HCl enthielten. Folglich hat sich die entwickelte Methode als einfacher und umweltfreundlicher erwiesen. Tabelle 10 enthält eine detaillierte Beschreibung jedes analytischen ESA-Scores, der mit der vorgeschlagenen Methode erstellt wurde.

Die Grundlage von GAPI ist ein dreifarbiges Phasenpiktogramm, das aus fünf Pentagrammen besteht. Das zur Darstellung jedes Schritts des Analyseprozesses verwendete Pentagramm symbolisiert die Umweltauswirkungen dieses Schritts. Die drei Farben Grün, Gelb und Rot geben den Grad der Umweltbelastung an. GAPI verdeutlicht den Vorteil der Kombination der Vorteile der ESA, da es sowohl einen kurzen Überblick als auch eine gründliche Analyse darüber bietet, wie umweltfreundlich verschiedene Schritte des Analyseprozesses sind23. GAPI wurde auch verwendet, um die grüne Eigenschaft in jedem Schritt als halbquantitatives Tool zu bestimmen. Die vorgeschlagene Methode erzeugt wenig Abfall und erfordert eine geringe Menge ungiftiger Chemikalien. Darüber hinaus ist die Methode direkt und dient der Qualifizierung und Quantifizierung. Das Piktogramm in Tabelle 10 zeigt, dass die zufriedenstellenden Ergebnisse auf eine hervorragende grüne Methodik hinweisen.

Zur Bestimmung von BEN-HCl in kommerziellen Augentropfen und künstlichem Kammerwasser wurde eine effiziente, schnelle, empfindliche und umweltfreundliche spektrofluorimetrische Methode entwickelt. Die vorgeschlagene Technik basiert auf der Wechselwirkung von Fluorescamin mit der primären Aminogruppe von BEN-HCl bei Raumtemperatur. Bei 483 nm wurde der RFI des Reaktionsprodukts nach Anregung bei 393 nm gemessen. Die Einführung einer analytischen Quality-by-Design-Methodik ermöglichte eine sorgfältige Untersuchung und Optimierung der entscheidenden experimentellen Parameter. Das Grünprofil der entwickelten Methode wurde mit den Tools Analytical ESA und GAPI verifiziert. Die vorgeschlagene Methode beseitigt die Mängel der zuvor beschriebenen Ansätze und könnte zur Schätzung des genannten Arzneimittels in Qualitätskontrolllabors eingesetzt werden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken der Researchers Supporting Project-Nummer (RSP2023R516) an der King Saud University, Riad, Saudi-Arabien. Die Autoren danken dem Dekanat für wissenschaftliche Forschung der Shaqra University für die Unterstützung dieser Arbeit.

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, College of Pharmacy, Shaqra University, Shaqra, 11961, Saudi-Arabien

Mohamed A. El Hamd

Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, South Valley University, Qena, 83523, Ägypten

Mohamed A. El Hamd

Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Mansoura-Universität, Mansoura, 35516, Ägypten

Mahmoud El-Maghrabey

Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, 33511, Ägypten

Gala Magda

Abteilung für Pharmazie, College of Pharmacy, King Saud University, Riad, 11451, Saudi-Arabien

Wael A. Mahdi und Sultan Alshehri

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Menoufia-Universität, Shebin Elkom, 32511, Ägypten

Amr KA Bass

Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Menoufia-Universität, Shebin Elkom, 32511, Ägypten

Hany A. Batakoushy

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MAE: Konzeptualisierung, Methodik, Datenkuration, Validierung, Schreiben – Originalentwurf. ME: Konzeptualisierung, Datenkuration, Validierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. GM: Methodik, Datenkuration, Validierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. WAM & SA: Ressourcen, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. AKAB: Visualisierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. HAB: Konzeptualisierung, Methodik, formale Analyse, Visualisierung, Validierung, Schreiben – Originalentwurf. Alle Autoren haben das Manuskript zur Veröffentlichung freigegeben.

Korrespondenz mit Mohamed A. El Hamd, Mahmoud El-Maghrabey, Galal Magdy oder Hany A. Batakoushy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

El Hamd, MA, El-Maghrabey, M., Magdy, G. et al. Anwendung von Quality-by-Design zur Einführung einer umweltfreundlichen fluorogenen Bestimmung von Benoxinathydrochlorid in Augentropfen und künstlichem Kammerwasser. Sci Rep 13, 8559 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35347-6

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Eingegangen: 3. April 2023

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35347-6

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