Rhizobienwanderung zu Wurzeln, vermittelt durch FadL

Nov 19, 2023

The ISME Journal Band 17, Seiten 417–431 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Migration von der Rhizosphäre zur Rhizoebene ist ein wichtiger Auswahlprozess beim Zusammenbau des Wurzelmikrobioms, der jedoch nicht vollständig verstanden wird. Rhizobiales-Mitglieder sind im Kernwurzelmikrobiom von Landpflanzen überrepräsentiert, und hier berichten wir über eine genomweite Transposonsequenzierung der Rhizoplane-Fitnessgene des nützlichen Sinorhizobium fredii auf wilden Sojabohnen, kultivierten Sojabohnen, Reis und Mais. Es waren nur wenige Gene an der Kolonisierung von Rhizoplaneten in einem breiten Wirtsspektrum beteiligt. Die fadL-Mutante ohne Fettsäuretransporter zeigte hohe Kolonisierungsraten, während Mutationen in exoFQP (kodierende Membranproteine, die die Exopolysaccharid-Polymerisation und -Sekretion steuern), jedoch nicht solche in Exo-Genen, die für die Exopolysaccharid-Biosynthese essentiell sind, zu stark beeinträchtigten Kolonisierungsraten führten. Diese Variation war nicht durch ihre Überlebensfähigkeit in Rhizosphäre und Rhizoebene und die damit verbundene Biofilm- und Exopolysaccharidproduktion erklärbar, sondern steht im Einklang mit ihrer Migrationsfähigkeit in Richtung Rhizoebene und der damit verbundenen Oberflächenmotilität und der Mischung von Quorum-Sensing-AHLs (N-acylierte L-Homoserinlactone). . Genetische und physiologische Beweise deuten darauf hin, dass FadL die Aufnahme langkettiger AHLs vermittelte, während ExoF die Sekretion kurzkettiger AHLs vermittelte, was sich negativ auf die Biosynthese langkettiger AHLs auswirkte. Die fadL- ​​und exoF-Mutanten hatten erhöhte bzw. abgereicherte extrazelluläre langkettige AHLs. Eine synthetische Mischung langkettiger AHLs, die die der fadL-Mutante nachahmt, kann die Motilität der Rhizobienoberfläche verbessern. Als diese AHL-Mischung in die Rhizosphäre gelangte, wurden die Migration zu Wurzeln und die Rhizoplane-Besiedlung von S. fredii auf diffusionsfähige Weise verstärkt. Diese Arbeit fügt neue Teile hinzu, die extrazelluläre AHLs verwalten, die die Bakterienmigration in Richtung Rhizoplane modulieren. Das FadL-ExoFQP-System ist in Alphaproteobakterien konserviert und kann das „Heimleben“ verschiedener Keystone-Rhizobakterien prägen.

Trotz eines ständig wachsenden Katalogs von Prokaryotenarten [1] kommen weltweit nur wenige Taxa in Böden vor [2]. Bodeneigenschaften spielen eine wichtigere Rolle als Pflanzengenotypen bei der Bestimmung der Zusammensetzung wurzelassoziierter Bakteriengemeinschaften [3, 4]. In diesem Zusammenhang haben viele Studien außerdem eine Untergruppe von Gemeinschaftsmitgliedern identifiziert, die an mehreren geografischen Standorten mit unterschiedlichen Bedingungen, wie Reis [5], Zitrusfrüchten [6], Zuckerrohr [7] und verschiedenen Hülsenfrüchten, reproduzierbar mit einer Pflanzenart assoziiert sind Arten [8]. Verfügbare Beweise stützen die Etablierung eines mehrstufigen Modells für den Aufbau von Wurzelmikrobiomen, sequentiell vom Massenboden über die Rhizosphäre und die Rhizoebene zur Endosphäre, wobei die Rhizoebene ein Auswahltor ist [5, 9]. Dieses mehrstufige Muster wurde ausführlich beschrieben, aber die zugrunde liegenden Gen-Umwelt-Interaktionen, die die Verteilung und Häufigkeit von Rhizobakterien in verschiedenen Nischen (Massenboden, Rhizosphäre und Rhizoebene) beeinflussen, bleiben weitgehend unerforscht [10,11,12]. Diese Wissenslücke verhindert die ultimative evolutionäre Erklärung für das „Heimatleben“ von Rhizobakterien in diesen ökologischen Nischen [12].

Die genomweite Identifizierung von Rhizoplane-Fitnessgenen von Modell-Rhizobakterien wurde durch den Tn-seq-Assay unter kontrollierten Bedingungen erheblich beschleunigt [13,14,15,16,17,18]. In diesen Hochdurchsatzstudien wurde jedoch nicht auf funktionelle Charakterisierungen dieser Fitnessgene in verschiedenen Kolonisierungsschritten eingegangen. Das aktuelle mehrstufige Kolonisierungsmodell beinhaltet Chemotaxis in Richtung Wurzeln, Anheftung und anschließende Bildung eines mehrzelligen Biofilms auf der Rhizoebene, was durch kumulative umgekehrte genetische Beweise verschiedener Rhizobakterien gestützt wird (19). Chemische Gradienten von Wurzelexsudaten sollen als entscheidende Bedingungen (z. B. Signalfunktion) und Ressourcen (Nährwert) dienen, die unterschiedlich mit beweglichen Bakterien interagieren, um den Migrationsprozess in Richtung Wurzelnische zu gestalten [20, 21]. Liganden, die von bakteriellen Chemorezeptoren direkt erkannt werden, sind größtenteils unbekannt [22], obwohl eine Chemoeffektorfunktion für organische Säuren, Kohlenhydrate, Zuckeralkohole, Aminosäuren und Pflanzenhormone vorgeschlagen wurde [23]. Bei der durch verschiedene bakterielle Adhäsine vermittelten Rhizoplane-Anlagerung [24] gehen bewegliche Bakterien allmählich in sessile Formen über, woraufhin das Wachstum und die Reifung von in die Matrix eingebetteten Bakteriengemeinschaften (Exopolysaccharide (EPS), eDNA, eRNA, Proteine, Lipide und andere) eintreten Biomoleküle), also der mehrzellige Biofilm [25]. Biofilm ist die „Heimat“ für mehrere Zellen derselben oder verschiedener Spezies, die über hochkonservierte Quorum-Sensing-Signale N-Acylhomoserinlactone (AHLs) miteinander kommunizieren [26]. Im Gegensatz dazu bleibt unklar, inwieweit der dichteabhängige Quorum-Sensing-Prozess an der Migration in Richtung der Wurzelnische beteiligt ist [19, 27, 28]. Dies ist für das Verständnis und die Entwicklung des Wurzelmikrobiomaufbaus von entscheidender Bedeutung [29, 30].

Rhizobiales und Burkholderiales gehören zum Kernwurzelmikrobiom von Landpflanzen [31, 32]. Diese Ordnungen sind sowohl mit nützlichen Rhizobien angereichert, die mit Hülsenfrüchten assoziiert sind, als auch mit verschiedenen Pflanzenpathogenen [8], die intensiv auf ihre molekularen Wechselwirkungen mit Wirten nach der Rhizoplane-Kolonisierung untersucht wurden [33,34,35,36]. Rhizobien zeichnen sich durch ihre intrazelluläre Infektion und Stickstofffixierung in Hülsenfruchtknötchenzellen aus [33] und können als Pionier der Wurzelmikrobiota von Hülsenfrüchten angesehen werden. Diese ausgeprägte Symbiose zwischen den Königreichen wird durch die spezifische Erkennung von Flavonoiden aus Hülsenfrüchten durch den rhizobialen Transkriptionsregulator NodD und die anschließende Aktivierung anderer an der Biosynthese von Lipochitooligosacchariden beteiligter Nod-Gene (bekannt als Nod-Faktoren) initiiert, die wiederum spezifisch vom Wirtsrezeptor erkannt werden, um zu induzieren nachgeschaltete Infektion und Knötchenmorphogenese [36]. Flavonoide wurden aufgrund früherer Studien auch als Chemoeffektor für Rhizobien vorgeschlagen [20], was kürzlich durch neue Erkenntnisse zu Colösungsmitteln, die normalerweise zum Auflösen von Flavonoiden verwendet werden, in Frage gestellt wurde [37]. Darüber hinaus wird immer wieder über Rhizobien als Endophyten verschiedener Pflanzenarten berichtet, und ihre pflanzenwachstumsfördernde Wirkung auf Getreide wie Reis [38, 39], Weizen [40, 41] und Mais [42] wurde nachgewiesen. Obwohl die molekularen Wechselwirkungen zwischen Rhizobien und ihren Wirten nach der Rhizoplane-Kolonisierung intensiv untersucht wurden [34, 36], ist weitgehend unbekannt, wie nützliche Rhizobien verschiedene Landpflanzen erfolgreich besiedeln.

Um Rhizobienmaschinen zu untersuchen, die an der Kolonisierung von Rhizoplanen in einem breiten Wirtsbereich beteiligt sind, konzentrierten wir uns auf Sinorhizobium fredii, einen fakultativen Mikrosymbionten verschiedener Hülsenfruchtarten mit einem breiten Wirtsbereich (43, 44). Tn-seq wurde für die genomweite Analyse der Rhizoplane-Kolonisierungsgene von S. fredii CCBAU25509 (im Folgenden SF2) auf wilder Sojabohne (Glycine soja W05), kultivierter Sojabohne (Glycine max cv. JD17) und Mais (Zea mays cv. ZD958) verwendet. und Reis (Oryza sativa cv. Nipponbare). Dies ermöglichte die Identifizierung einer robusten Liste von Rhizoplane-Kolonisierungsgenen mit breitem Wirtsbereich. Innerhalb dieser Liste bestätigte die umgekehrte Genetik, dass Mutationen in fadL (kodierend für einen Transporter der äußeren Membran) und exoFQP (kodierend für Membranproteine, die die Polymerisation und Sekretion von EPSs steuern) zu einer verbesserten bzw. beeinträchtigten Fähigkeit zur Rhizoplane-Kolonisierung in einem breiten Wirtsbereich führten. Für verwandte Mutanten wurden Merkmale ermittelt, die mit der Überlebensfähigkeit von Rhizosphäre und Rhizoplane (EPS- und Biofilmproduktion) und der Migration zu Wurzeln (Schwimmen und Oberflächenmotilität) verbunden sind. Schließlich zeigten wir, dass die entgegengesetzte Rhizoplane-Kolonisierungskompetenz zwischen fadL- ​​und exoFQP-Mutanten mit ihrer unterschiedlichen Migrationsfähigkeit zu Wurzeln und der damit verbundenen Oberflächenmotilität und den extrazellulären Quorum-Sensing-langkettigen AHLs übereinstimmt. Die AHL-Quantifizierung ermöglichte es uns auch, ein Arbeitsmodell für die Migration zu Wurzeln vorzuschlagen, das eine FadL-ExoFQP-abhängige Modulation der extrazellulären langkettigen AHL-Homöostase beinhaltet. Dieses Modell wurde in einem Rhizoplane-Kolonisierungsexperiment unter Verwendung einer synthetischen Mischung langkettiger AHLs weiter verifiziert.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle S1 aufgeführt, und die Primer sind in Tabelle S2 aufgeführt. Rhizobien wurden bei 28 °C in TY-Medium gezüchtet [45]. Escherichia coli-Stämme wurden bei 37 °C in Luria-Bertani (LB)-Medium gezüchtet. Agrobacterium tumefaciens wurde bei 28 °C in LB-Medium gezüchtet. Konzentrationen von Antibiotika wurden bereits früher beschrieben [45, 46]. Der Bioscreen C (Oy Growth Curves Ab Ltd, Raisio, Finnland) wurde zur Bestimmung der Wachstumskurven von Teststämmen verwendet.

Um gesättigte Transposon-Insertionsmutantenbibliotheken zu konstruieren, wurde das von pSAM_Bt [47] abgeleitete, von Mariner-Transposonen getragene pSAM_Sf über Konjugation in SF2 eingeführt. Nach dem Wachstum wurde die Paarungsstelle abgekratzt und in 0,85 %iger NaCl-Lösung resuspendiert. Diese Paarungsmischung (100 µl pro Platte) wurde weiter auf 600 TY-Agarplatten (90 × 90 mm) ausgebreitet, die Nalidixinsäure (30 µg/ml), Trimethoprim (10 µg/ml) und Kanamycin (50 µg/ml) enthielten, und zwar steril Glasperlen gelöst und 3 Tage bei 28 °C inkubiert. Etwa 600.000 Kolonien wurden geerntet, wodurch die Input-Transposon-Insertionsmutantenbibliothek für nachfolgende Experimente entstand. Drei unabhängige Bibliotheken wurden erstellt und direkt in drei unabhängigen Experimenten verwendet.

Samen von wilden Sojabohnen, kultivierten Sojabohnen, Reis und Mais wurden 30 Sekunden lang mit 95 % Ethanol behandelt und 3 Minuten lang in 17 %iger NaClO-Lösung (Gew./Vol.) oberflächensterilisiert (wobei wilde Sojabohnensamen mit konzentrierter Schwefelsäure vorbehandelt wurden). 3 Minuten), dann fünf bis sieben Mal mit autoklaviertem entionisiertem Wasser gewaschen und auf 0,8 % Agarplatten bei 28 °C im Dunkeln 48 Stunden lang gekeimt. Um falsch negative Ergebnisse beim Fitness-Gen-Screening zu minimieren, wurde die Input-Bibliothek in 0,85 %iger Kochsalzlösung bei OD600 = 1 resuspendiert. Die Input-Bibliothek wurde auf das Filterpapier einer Pflanzenkulturschale (0,8 % Agar; Nährlösungsmedium mit niedrigem N-Gehalt) geimpft [45 ]). Gleichzeitig wurden 2 Tage alte Sämlinge in diese Kulturschalen überführt. Anschließend wurden die Wurzeln bei 7 dpi (Tage nach der Inokulation) geerntet, gepoolt, gewogen, fünfmal mit 0,85 %iger NaCl-Lösung gewaschen und pro 10 g in 15 ml 0,85 %iger NaCl-Lösung suspendiert. Nach der Ultraschallbehandlung (50 Hz, zweimal 30 s) wurde die Suspension 32 Stunden lang in 200 ml TY-Medium mit Antibiotika inkubiert, um den weiteren Aufbau der Tn-seq-Bibliothek für diese Rhizoplane-Proben (WS7d, CS7d, R7d und Z7d) zu erleichtern. Zu den Kontrollproben gehörten 32-Stunden-TY-Kulturen der Input-Bibliothek (TY) und die TY-Kulturen von Filterpapieren, die aus der Pflanzenkulturschale bei 1 hpi (Stunde nach der Inokulation; F1h) oder 7 dpi (F7d) entnommen wurden. Drei unabhängige Mariner-Transposon-Insertionsbibliotheken wurden in drei unabhängigen Experimenten als Eingabebibliotheken verwendet (Abb. 1).

Drei unabhängige Mariner-Transposon-Insertionsbibliotheken von S. fredii CCBAU25509 (SF2) wurden in drei unabhängigen Experimenten als Input-Impfmittel verwendet. Ihre Proben 1 Stunde nach der Inokulation (F1h) und 7 Tage nach der Inokulation (F7d) auf dem Filter der Pflanzenkulturschale wurden als Kontrollproben für die Rhizoplanproben von vier Testpflanzenarten (CS7d, WS7d, R7d und Z7d) verwendet. . Um den Aufbau der Tn-seq-Bibliothek zu erleichtern, wurden alle Ausgabeproben 32 Stunden lang im TY-reichen Medium kultiviert, und die Eingabebibliotheken wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Kontrolle (TY) kultiviert.

DNA aus den gesammelten Proben wurde mit einem TIANamp Bacteria DNA Kit (Tiangen) extrahiert und einer enzymatischen Fragmentierung mit MmeI (New England Biolabs) unterzogen. Etwa 3 μg qualifizierte DNA wurden mit 3 μl (6 Einheiten) MmeI in einem Gesamtvolumen von 200 μL 2,5 Stunden lang bei 37 °C verdaut. Anschließend wurden 2 μl alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP; New England Biolabs) zugegeben und das Reaktionssystem 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Doppelstrangadapter mit unterschiedlichen Barcodes wurden an die mit einem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen) gereinigten Restriktionsfragmente ligiert und über Nacht bei 16 °C inkubiert. Transposon-Insertionsstellen, die Sequenzen flankieren, wurden durch PCR unter Verwendung von Universal- und P7-Tn-Primern und Q5-DNA-Polymerase (New England Biolabs) angereichert (2 Minuten bei 98 °C; 22 Zyklen bei 98 °C für 10 Sekunden, 72 °C für 25 Sekunden). und 72 °C für 30 s; gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 min). PCR-Produkte wurden auf einem 1,8 %igen Agarosegel laufen gelassen und mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gereinigt. Die DNA wurde mit einem Nanodrop quantifiziert und einer Single-End-Sequenzierung auf der NextSeq 550AR-Plattform (ANORAD Gene Technology Co., Ltd) unterzogen.

Rohdaten wurden mit fqgrep (https://github.com/indraniel/fqgrep) gefiltert, um den Adapter und das Transposon zu identifizieren, und die genomische DNA neben dem Transposon wurde extrahiert. Bowtie wurde verwendet, um Lesevorgänge auf das SF2-Genom abzubilden [48] und eine .sam-Ausgabedatei zu generieren, die dann verwendet wurde, um mithilfe von summary_mappings.py (https://github.com/elijweiss/) eine Datei im .wig-Format der ausgerichteten genomischen DNA zu erstellen. Tn-seq). Die resultierenden .wig-Dateien wurden mit der „Resampling“-Methode von TRANSIT mit der TTR-Normalisierungsmethode (getrimmte Gesamtlesevorgänge) analysiert [49]. Es wurden nur Einfügungen innerhalb der 5–95 % ORFs in Betracht gezogen, um die mögliche Wirkung nicht störender Einfügungen zu minimieren [50]. Als Kontrollen wurden entweder einzelne Eingabebibliotheken oder F1h-Proben verwendet.

Um die Tn-seq-Ergebnisse zu verifizieren, wurden repräsentative Gene durch Insertion von pCM351-Derivaten [51], die ein internes Fragment einzelner Zielgene tragen, mit den in Tabelle S2 aufgeführten Primern mutiert. Alle pCM351-Derivate wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert und dann in SF2 konjugiert. Für die In-Frame-Deletion von fadL, exoF, traI, sinI und flaA in SF2 oder verschiedenen Hintergründen wurde ein Seamless Assembly Cloning Kit (Taihe Biotechnology, Peking, China) verwendet, um pJQ200SK [52]-Derivate wie zuvor beschrieben zu konstruieren [53]. Die entsprechenden Primer sind in Tabelle S2 aufgeführt. Die korrekten manipulierten Plasmide, die von positiven Klonen getragen wurden, wurden mittels PCR und Sanger-Sequenzierung verifiziert und dann in Rhizobien konjugiert. Gegen Gentamicin resistente Single-Crossover-Klone wurden außerdem einer Gegenselektion für Doppelrekombinanten unter Verwendung von 5 % Saccharose unterzogen. Um komplementäre Mutantenstämme zu konstruieren, wurden die Fragmente, die entsprechende kodierende Sequenzen und stromaufwärts gelegene Promotorregionen enthielten, in pBBR1MCS-2 kloniert [54]. Die pBBR1MCS-2-Derivate mit korrekten klonierten Sequenzen wurden durch Konjugation in Rhizobien eingeführt. Um GFP- und mCherry-markierte S. fredii-Stämme zu erzeugen, wurden pRJPaph-bjGFP und pRJPaph-mChe [55] durch Konjugation an S. fredii übertragen. Alle Insertionsmutanten, In-Frame-Deletionsmutanten, komplementären Mutantenstämme und markierten Stämme wurden durch Kolonie-PCR und Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Um die Knötchenbelegung von Rhizobien zu bestimmen, wurden die Mutanten mit ihren Elternstämmen im Verhältnis 1:1 (OD600 = 0,2) gemischt und auf Wirtspflanzen geimpft, die in Vermiculit gezüchtet wurden, das mit dem Nährlösungsmedium mit niedrigem N-Gehalt angefeuchtet war (Luzernensamen wurden mit der gleichen Methode sterilisiert). als wilde Sojabohnensamen). Bei 30 dpi wurden die Knötchen oberflächensterilisiert (95 % Ethanol für 30 Sekunden und 17 % NaClO für 3 Minuten) und Knötchenisolate wurden durch ihr Wachstum auf TY-Platten mit entsprechenden Antibiotika und PCR mit Primern, die auf stammspezifische Fragmente abzielten, identifiziert.

Für das Rhizoplane-Kolonisierungsexperiment wurde das gleiche System verwendet, das für die Sammlung von Tn-seq-Proben beschrieben wurde, mit einer reduzierten Inokulationsdichte, wie unten beschrieben. Die Rhizobienkulturen über Nacht wurden in 0,85 %iger Kochsalzlösung, die als Impfmittel verwendet wurde, auf eine OD600 von 0,2 eingestellt. Bei 7 dpi wurden koloniebildende Einheiten (KBE) in Rhizoplane-Proben oder auf dem Filterpapier durch Inkubation verdünnter Proben auf TY-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotika bestimmt. Um die Überlebensfähigkeit von Rhizobien auf wilden Sojabohnenwurzeln zu bestimmen, wurden Sämlinge mit einer Wurzellänge von 3 cm für 10 s in 300 µl Rhizobienlösung mit OD600 = 0,2 gegeben, dann an der Luft getrocknet und in die Pflanzenkulturschale überführt. Anschließend wurden die Wurzeln bei 1 hpi und 7 dpi geerntet und die KBE in Rhizoplanes-Proben wie oben beschrieben bestimmt. Um den Migrationsprozess von der Rhizosphäre zur Rhizoebene zu charakterisieren, wurden 2 µl Wildtyp oder Mutanten mit OD600 = 0,8 (ca. 1,6 × 106 KBE) symmetrisch in 1 cm, 2 cm, 3 cm und 4 cm Entfernung von wilden Sojabohnenkeimlingen inokuliert die Pflanzenkulturschale. Bei 7 dpi wurden die KBE in Filterpapierproben an Impfstellen und in Rhizoplane-Proben wie oben beschrieben bestimmt. Dieses symmetrische Inokulationsverfahren wurde auch verwendet, um die Diffusionswirkung langkettiger AHLs (2 µl Lösung mit 45 ng 3-OXO-C12-HSL, 52 ng C14-HSL und 1 µg 3-OXO-C14-HSL) zu testen Rhizoplane-Kolonisierung von SF2 oder Mutanten (Impfmittel: etwa 1,6 × 106 KBE), d. h. wobei die Inokulationspositionen sowohl von AHLs als auch von Bakterien in symmetrischen Abständen zu wilden Sojabohnenkeimlingen variieren.

Die Biofilmbildung wurde wie zuvor beschrieben [56] mit Modifikationen bestimmt. Über Nacht wurden TY-Kulturen von Rhizobien zentrifugiert, zweimal mit 0,85 %iger NaCl-Lösung gewaschen und auf OD600 = 0,1 in TY eingestellt. Die resultierende Kultur von 100 µl wurde in Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (8 Vertiefungen pro Stamm) inokuliert, die dann mit Parafilm versiegelt und 48 Stunden lang in einer Wachstumskammer bei 28 °C platziert wurden. Das Bakterienwachstum wurde bei OD600 auf einem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt. Planktonische Bakterien wurden mit einer Pipette entfernt und die Platten wurden dreimal mit 0,85 %iger NaCl-Lösung gewaschen. Die Vertiefungen wurden geleert und 10 Minuten lang mit 150 µl 0,1 % (Gew./Vol.) Kristallviolett gefärbt und dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Die Mikrotiterplatte wurde auf Gewebe umgedreht, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und an der Luft getrocknet. Das verbleibende Kristallviolett wurde durch Zugabe von 150 µl 95 %igem (v/v) Ethanol und 15-minütiger Inkubation solubilisiert. Schließlich wurden 125 μl der Kristallviolett/Ethanol-Lösung aus jeder Vertiefung in eine Platte mit 96 Vertiefungen überführt und die OD590 mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

Exopolysaccharide (EPS) wurden wie zuvor beschrieben gereinigt und quantifiziert (57). Kurz gesagt, die Bakterien wurden 5 Tage lang im M9-Medium kultiviert und geerntet, und zur Standardisierung wurde die OD600 gemessen. Der EPS enthaltende Überstand wurde durch Zentrifugation (2449 g für 30 Minuten) erhalten und die Fraktion mit hohem Molekulargewicht (HMW) wurde durch Zugabe von 3:1 Volumen 95 % kaltem Ethanol ausgefällt. Der HMW-Niederschlag wurde durch Zentrifugation (2449 g für 30 Minuten) gesammelt und dem erhaltenen Überstand wurden weitere sieben Volumina Ethanol zugesetzt, um die Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht auszufällen. Diese beiden Fraktionen wurden dann lyophilisiert und gewogen.

Um das Schwimmen von Rhizobien zu beurteilen, wurden Bakterienkolonien mit einem sterilen Zahnstocher in die Mitte von Schwimmagarplatten (TY, 0,3 % Agar mit Kongorot) übertragen. Für die Oberflächenmotilität wurden 2 µl einer Übernachtkultur (OD600 = 0,8) der Teststämme zentral auf der Oberflächenmotilitätsagarplatte (TY, 0,5 % Agar mit Kongorot) punktuell inokuliert. Die Platten wurden 7 Tage lang mit der Vorderseite nach oben bei 28 °C inkubiert und die maximalen Durchmesser einer entsprechenden Schwimm- oder Oberflächenmotilitätskolonie bestimmt.

Um die konkurrierende Oberflächenmotilität von Mutanten und SF2 zu testen, wurden mCherry-markierte Mutanten und GFP-markiertes SF2 in unterschiedlichen Verhältnissen (10 %, 30 %, 50 %, 70 % und 90 %) gemischt und auf Oberflächenmotilitätsplatten (TY) inkubiert , 0,5 % Agar) für 1 Woche. Um die kompetitive Schwimmmotilität der mCherry-markierten flaA-Mutante und des GFP-markierten SF2 zu testen, wurden zwei Stämme im Verhältnis 1:1 gemischt und in die Mitte der Schwimmagarplatte (TY, 0,3 % Agar) geimpft. Sieben Tage später wurde jede Kolonie mit einem Leica-Fluoreszenz-Stereomikroskop beobachtet (Anregungslichtquelle: 488 nm zum Nachweis von GFP-markiertem SF2 und 546 nm zum Nachweis von mCherry-markierten Mutanten).

Um die Wirkung langkettiger AHLs auf die Oberflächenmotilität von Bakterien zu analysieren, wurde jeder mit mCherry markierte Stamm im Verhältnis 1:1 mit seinem entsprechenden unmarkierten Stamm bis zu einer Konzentration von OD600 = 0,8 gemischt und dann punktuell mit langkettigen AHLs inokuliert AHLs (2 µl Bakterienlösung enthalten 45 ng 3-OXO-C12-HSL, 52 ng C14-HSL und 1 µg 3-OXO-C14-HSL) auf der Mitte der Oberflächenmotilitätsagarplatte (TY, 0,5 % Agar mit Kongorot). Sieben Tage später wurde der Koloniedurchmesser aufgezeichnet und Bilder mit einem Leica-Fluoreszenzstereomikroskop (Anregungslichtquelle: 546 nm) aufgenommen.

Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) [46] wurde als Indikatorstamm zum Nachweis extrazellulärer AHLs von S. fredii-Stämmen verwendet. Teststämme wurden 3 Tage lang auf Oberflächenmotilitätsplatten mit oder ohne X-Gal kultiviert, und dann wurde KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) (OD600 = 0,1) außerhalb der Rhizobienkolonie geloopt. Bei 4 dpi von KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) wurden die Platten mit X-Gal fotografiert und die Platten ohne X-Gal wurden zur Quantifizierung der β-Galactosidase-Aktivität von KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) verwendet ), um den extrazellulären AHL-Gehalt von Rhizobien widerzuspiegeln.

Um intra- und extrazelluläre kurz- und langkettige AHLs zu messen, wurden Rhizobien 32 Stunden lang bei 28 °C im TY-Medium inkubiert (stationäre Phase). Der Überstand, der extrazelluläre AHLs enthielt, wurde durch Zentrifugation (2449 g für 30 Minuten) erhalten. Das Pellet wurde zweimal mit 0,85 % NaCl gewaschen, resuspendiert, beschallt und dann zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten, der intrazelluläre AHLs enthielt. Die resultierenden Proben wurden zweimal mit Ethylacetat in Chromatographiequalität in gleichen Volumina extrahiert und die organische Phase eingedampft. Die Extrakte wurden in 1 ml Methanol:Wasser (1:1 v/v) mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure gelöst und mikrofiltriert (0,22 µm). Die resultierende Probe von 1 µL wurde in das HPLC-System injiziert, das mit einer TACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 × 100 mm, 1,8 µm Partikelgröße) (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ausgestattet war. Elutionsmittel waren 0,1 % Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) und in Acetonitril (Lösungsmittel B). Die Flussrate wurde auf 300 μl/min eingestellt, der Mischungsanteil änderte sich während der ersten 9 Minuten von 40 % Lösungsmittel B auf 98 % Lösungsmittel B, wurde 2 Minuten lang beibehalten und dann kehrte die Säule zu den Ausgangsbedingungen zurück. Alle AHLs-Moleküle haben einen hohen Serin-Lacton-Ring, der in der HPLC-Massenspektrometrie ein charakteristisches Fragment mit m/z von 102 bildet [58]. Nach diesem Prinzip wurde die HPLC-Q-Exactive-PRM-Methode etabliert. Analytische Standards (Reinheit > 99 %) von C8-HSL, 3-OXO-C8-HSL, C12-HSL, 3-OXO-C12-HSL, C14-HSL, 3-OXO-C14-HSL wurden von Sigma (Darmstadt) bezogen , Deuschland). Die 1 µg/ml-Lösungen wurden seriell auf 1/4, 1/16, 1/256 und 1/1024 verdünnt. Massenspektrometrische Analysen wurden mit einem Q Exactive HF-X Quadrupolfallen-Massenspektrometriegerät (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Vorläufer-Ionen-Scanning-Experimente wurden im Positivionenmodus durchgeführt, um m/z 102 zu überwachen.

Diese Arbeit konzentrierte sich auf SF2, das ein typisches mehrteiliges Genom von Sinorhizobium (Chromosom, Chromid und Symbioseplasmid) beherbergt (59). Um eine genomweite Untersuchung der Rhizoplane-Kolonisierungsgene von SF2 durchzuführen (Abb. 1), wurde die Input-Mutantenbibliothek auf Filterpapier einer Pflanzenkulturschale inokuliert und die Output-Mutantenbibliotheken 1 Stunde nach der Inokulation (F1h) aus Filterpapieren gesammelt 7 Tage nach der Inokulation (dpi; F7d) und aus Rhizoplane von kultivierten Sojabohnen (CS7d), wilden Sojabohnen (WS7d), Reis (R7d) und Mais (Z7d) bei 7 dpi. Um den Aufbau der Tn-seq-Bibliothek zu erleichtern, wurden alle Ausgabemutantenbibliotheken einer 32-stündigen Kultivierung im TY-reichen Medium unterzogen, wobei die Eingabebibliotheken unter den gleichen Bedingungen wie die Kontrolle (TY) kultiviert wurden. Tn-seq ergab, dass die Transposon-Insertionsdichte in drei Eingabe- und 21 Ausgabeproben zwischen 57,03 und 86,99 % lag (Tabelle S3), was über dem Schwellenwert von 50 % Insertionsdichte für einen guten Tn-seq-Datensatz liegt (49). In drei unabhängigen Experimenten wurde ein reproduzierbarer Rhizosphäreneffekt beobachtet (Abb. S1), dh Rhizoplane-Proben (CS7d, WS7d, R7d und Z7d) bildeten im Vergleich zu denen von TY, F1h und F7d durchweg unterschiedliche Cluster. Es wurde auch eine beträchtliche Signatur von drei unabhängigen Eingabebibliotheken identifiziert (Daten S1, Daten S2 und Abb. S1). Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass stochastische Variationen zwischen mehreren unabhängigen Eingabebibliotheken berücksichtigt werden sollten, bevor Schlussfolgerungen zur Genfitness gezogen werden, was in früheren Studien, die auf nur einer Eingabebibliothek basierten, weitgehend übersehen wurde (49).

Basierend auf den Gen-Fitness-Scores von Rhizoplane-Proben (CS7d, WS7d, R7d und Z7d) im Vergleich zu entsprechenden F1h-Datensätzen (Abb. S2A; Daten S2) wurden 93, 91, 127 und 206 Gene als Rhizoplane-Kolonisierungsgene für Testpflanzen von identifiziert kultivierte Sojabohnen, wilde Sojabohnen, Mais und Reis, die jeweils 1,4–3,1 % des SF2-Genoms ausmachen (p-Werte < 0,01). Dieser Bereich ähnelt dem für Rhizoplane-Kolonisierungsgene in Sinorhizobium meliloti (2 %) [60] und Rhizobium leguminosarum bv. viciae (2,9 %) [17], Agrobacterium tumefaciens (2,9–4 %), [18], Pseudomonas aeruginosa (1,6 %) [15], Pseudomonas simiae (2 %) [13], Pseudomonas sp. WCS365 (3,8 %) [14], Azoarcus olearius (2,2 %) und Herbaspirillum seropedicae (2,7 %) [16]. Unter diesen Rhizoplane-Fitnessgenen waren 8, 8, 21 und 82 Gene spezifisch für kultivierte Sojabohnen, wilde Sojabohnen, Mais und Reis (Abb. S2A und Daten S2.1). Darüber hinaus wurden in drei unabhängigen Experimenten für mindestens eine Testpflanzenart 43 Gene reproduzierbar als Rhizoplane-Kolonisierungsgen identifiziert (Abb. S2B und Daten S2.2), die daher als robuste Liste von Rhizoplane-Kolonisierungsgenen für weitere Untersuchungen angesehen wurden . Die Kontrollproben aus Filterpapieren (F7d) bildeten im Vergleich zu den Rhizoplane-Proben in der hierarchischen Clusteranalyse einen deutlichen Cluster (Abb. S2B). Da für c09590 in den R7d.3- und Z7d.3-Datensätzen ein deutliches Rauschen beobachtet wurde, wurde eine c09590-Mutante konstruiert und mit SF2 im Verhältnis 1:1 unter den gleichen Bedingungen, die für die Tn-seq-Probensammlung verwendet wurden, co-inokuliert. Darüber hinaus wurde auch eine Mutante für c04390 konstruiert und im selben Experiment als Positivkontrolle verwendet. Die c09590- und c04390-Mutanten zeigten im Vergleich zu SF2 eine deutlich beeinträchtigte Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit im breiten Wirtsbereich (p-Werte < 0,001; Abb. S3), was die Tn-seq-Ergebnisse stützt (Abb. S2B).

Es gab 41 von 43 Genen, die einen positiven Beitrag zur Rhizoplane-Besiedlung leisteten. Diese Gene sind an der Reparatur von DNA (UvrA) und Protein (Pcm), der Translation (YchF und LepA), der Atmung (sieben mit Cytochrom C verwandte Proteine), dem Phosphonatstoffwechsel (PhnP), der antioxidativen Aktivität (SodA) und der Aufnahme von Eisen (III) beteiligt (c03990 und c04080) und Oligopeptid (b57060, b57070 und b57080), Lipoproteinbindung (c19900), Sekretion von EPS (ExoF, ExoP und ExoQ), Anabolismus für Tryptophan (TrpA, TrpB, TrpD und TrpE), Glutamat ( GltA, GltB und ArgD), Leucin (LeuA und LeuB), Methionin (MetA), IMP (PurC und PurF), AMP (PurA) und dUMP (Dcd). Innerhalb dieser Genliste wurden Homologe von 22 Genen auch als Rhizoplane-Kolonisierungsakteure (Daten S2.2) in S. meliloti-alfalfa (60), P. simiae-Arabidopsis thaliana (13), Pseudomonas sp. WCS365-A. thaliana [14], P. aeruginosa-Mais [15], A. olearius/H. seropedicae-Setaria viridis [16], R. leguminosarum-Erbse [17] oder Agrobacterium tumefaciens-Tomatenpaare [18]. Im Gegensatz dazu regulierten Gene, die für einen mutmaßlichen Anti-Sigma-Faktor (RsbU) und den einzigen bekannten hydrophoben Außenmembrantransporter FadL [61,62,63,64] kodieren, die Rhizoplane-Kolonisierung von SF2 negativ, wobei fadL eine stärkere Wirkung hatte (Abb. S2B). . In einer kürzlich durchgeführten Tn-seq-Untersuchung der Kolonisierungsgene von Aquitalea magnusonii auf der schwimmenden gesamten Wasserlinsenpflanze wurden die fadL-Mutanten im Ausgabepool angereichert, was auf einen negativen Einfluss auf die Kolonisierung hinweist [65].

Diese 43 Rhizoplane-Kolonisierungsgene weisen eine voreingenommene Replikonverteilung im mehrteiligen SF2-Genom auf: 81,4 % auf dem Chromosom, 18,6 % auf dem Chromid und 0 % auf dem Symbioseplasmid. Dies steht im Einklang mit früheren metabolischen Modellierungsbeweisen von S. meliloti, die zeigen, dass Sinorhizobium-Chromosom und -Chromid zur Fitness der Rhizosphäre beitragen [66], während die für das Symbioseplasmid kodierenden Gene hauptsächlich an der Etablierung und Aufrechterhaltung einer stickstofffixierenden Symbiose mit Hülsenfrüchten beteiligt sind [59]. Dennoch wurde über eine symbiotische Optimierung durch chromosomale und chromidische Gene berichtet [34, 67, 68], wobei EPS-Biosynthesegene auf Chromid intensiv hinsichtlich ihrer Rolle bei der Optimierung beider Infektionsprozesse von Sinorhizobium auf Hülsenfruchtpflanzen untersucht wurden [69, 70] und Biofilmbildung in vitro [71]. In dieser Arbeit kodieren exoF, exoP und exoQ unter den 8 Chromidgenen, die an der Rhizoplane-Kolonisierung beteiligt sind (Abb. S2B), Membranproteine, die die EPS-Polymerisation und -Sekretion steuern (Abb. 2A) [72,73,74,75,76,77] . Es war intuitiv unerwartet, dass verschiedene EPS-Biosynthesegene innerhalb desselben Genclusters von exoF, exoP und exoQ für die Rhizoplane-Kolonisierung nicht wesentlich waren (Abb. 2B, C). Dies impliziert ein Arbeitsmodell, dass andere unbekannte physiologische Funktionen von ExoF, ExoP und ExoQ eine wichtigere Rolle bei der Rhizoplane-Kolonisierung spielen als die EPS-Produktion.

A Voraussichtliche subzelluläre Lokalisierung von ExoP, ExoQ, ExoF und FadL. B Der Exo-Gencluster, der die Biosynthese, den Transport und den Abbau von Exopolysacchariden in SF2 steuert, und seine Transposon-Insertionsfrequenz in drei unabhängigen Experimenten (Zeilen) unter verschiedenen Bedingungen. Die Ergebnisse von fadL werden ebenfalls angezeigt. C Der vorhergesagte Weg der Exopolysaccharid-Biosynthese, des Transports und des Abbaus in SF2. G-6-P-Glucose-6-phosphat, F-6-P-Fructose-6-phosphat, Ac-Acetylgruppe, Ac-CoA-Acetyl-CoA, PEP-Phosphoenolpyruvat.

Wie oben beschrieben, führten Mutationen von fadL unter den Rhizoplane-Fitnessgenen mit breitem Wirtsbereich (Daten S2.2 und Abb. S2) zu außergewöhnlich hohen Rhizoplane-Kolonisierungsraten, während Mutationen in exoFQP an der EPS-Polymerisation und -Sekretion beteiligt waren, nicht jedoch in Exo-Gene, die für die EPS-Biosynthese erforderlich sind, führten zu stark beeinträchtigten Kolonisierungsraten. Um die gegensätzliche Rolle von FadL und ExoFQP bei der Rhizoplane-Kolonisierung zu verifizieren, wurden Mutanten von fadL, exoF, exoP und exoQ konstruiert. Darüber hinaus wurden zum Vergleich Mutanten von fünf Exo-Genen konstruiert, die an verschiedenen Schritten der EPS-Biosynthese und des EPS-Abbaus beteiligt sind: exoB (Vorläufersynthese), exoY (Priming-Glycosyltransferase), exoA (Glycosyltransferase), exoZ (Substitution) und exoK (Polysaccharidabbau) ( Abb. 2C). Diese Mutanten wurden einzeln mit SF2 im Verhältnis 1:1 unter den gleichen Bedingungen für Tn-seq co-inokuliert (Abb. 1). Ihre Konkurrenzfähigkeit bei der Rhizoplane-Kolonisierung stimmte im Allgemeinen mit den Tn-seq-Ergebnissen überein. Die fadL-Mutante war in den CS7d-, WS7d- und R7d-Behandlungen wettbewerbsfähiger als SF2 (Abb. 3A; p-Werte < 0,001), in Z7d jedoch nicht von SF2 zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu wurden die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten bei vier Pflanzenarten durch SF2 verdrängt (Abb. 3A; p-Werte < 0,001).

A Beeinträchtigte Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit der exoF-, exoQ- und exoP-Mutanten und erhöhte Leistung der fadL-Mutante. Testmutanten wurden einzeln mit dem Wildtyp-Stamm SF2 im Verhältnis 1:1 unter den gleichen Bedingungen wie für Tn-seq koinokuliert (Abb. 1; 1 ml Impfmittel mit OD600 = 0,2 hier). B Beeinträchtigte Knötchenbelegung bei in Vermiculit gewachsenen Hülsenfrüchten durch die exoF-, exoQ- und exoP-Mutanten und eine erhöhte Leistung der fadL-Mutanten. Der Wildtyp SF2 (WT) bildet wirksame Knötchen auf Glycine soja (wilde Sojabohne W05), jedoch nicht auf Glycine max cv. JD17 (kultivierte Sojabohne), während seine rhcV-Mutante wirksame Knötchen auf JD17 bilden kann. Die fadL-Mutanten der S. meliloti-Stämme SM01290 (CCBAU01290; BioSample: SAMN02388829) und SM2011 (BioSample: SAMN02603522) wurden auch an ihrem Wirt Medicago sativa (Luzerne) getestet. Es wird ein signifikanter Unterschied in der kompetitiven Rhizoplane-Kolonisierung und der Knötchenbelegung zwischen einzelnen Mutanten und WT angezeigt (T-Test mit einer Stichprobe; theoretischer Mittelwert = 0,5; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Fehlerbalken stellen die SD von drei biologischen Replikaten dar (Knötchen von mehr als 15 Pflanzen wurden analysiert und die Anzahl der Testknötchen wird angezeigt).

Die exoY-, exoA-, exoZ- und exoK-Mutanten waren in den CS7d-, WS7d- und R7d-Behandlungen nicht von SF2 zu unterscheiden, während die exoY-, exoZ- und exoK-Mutanten in Z7d eine beeinträchtigte Konkurrenzfähigkeit zeigten (33–43 %; p-Werte < 0,001). ), allerdings in geringerem Ausmaß als die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten (27–28 %). Die bemerkenswerte Ausnahme war die exoB-Mutante, die hier durch SF2 verdrängt wurde (Abb. 3A), während in Tn-seq-Daten aus Rhizoplane-Proben keine Erschöpfung der exoB-Mutanten beobachtet wurde (Abb. 2B). ExoB, das für eine UDP-Glucose-4-Epimerase kodiert, synthetisiert UDP-Galactose [78], die möglicherweise von anderen Mutanten innerhalb der Mischung der Mutantenbibliothek bereitgestellt wird. Diese Hypothese wird durch mehrere Beweislinien gestützt: (1) Ein kryptisches Uxe-Gen in Sinorhizobium kodiert für eine bifunktionale UDP-Zucker-4-Epimerase, die die Umwandlung von UDP-Xylose/UDP-Arabinose und UDP-Glukose/UDP-Galaktose sowie deren Überexpression katalysiert kann exoB funktionell ersetzen [79]; (2) dieses uxe-Gen wird jedoch im Allgemeinen durch den globalen Silencer MucR in Wildtyp-Sinorhizobium-Stämmen unterdrückt [79,80,81]; (3) Eine beträchtliche Anzahl von Transposon-Insertionen wurde in zwei mucR-Kopien (c08920 und a45250; 377–758 Insertionen pro Gen) innerhalb der Tn-seq-Daten von Rhizoplane-Proben beobachtet (Daten S1). Der drastische Rhizoplane-Kolonisierungsdefekt der exoB-Mutante im Vergleich zu den exoY-, exoA-, exoZ- und exoK-Mutanten (Abb. 4A) kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die von ExoB synthetisierte UDP-Galactose ein Vorläufer für mehrere galactosehaltige Polysaccharide ist (Lipopolysaccharide, Succinoglycan und Galactoglucan) [82].

A Schwimmfähigkeit (links, 0,3 % Agar) und Oberflächenmotilität (rechts, 0,5 % Agar) auf der TY-Platte mit Kongorot. *, deutliche Risse in Kolonien der exoQ-, exoF- und exoP-Mutanten. B, C Durchmesser der Kolonien unter Schwimm- (B) und Oberflächenmotilitäts- (C) Bedingungen, wie in (A) gezeigt. D Fluoreszenzstereomikroskopische Bilder der Oberflächenmotilitätsfähigkeit der fadL-Mutante (rot) und der exoF-Mutante (rot) im Vergleich zum Wildtyp-SF2 (WT; grün) in einer Impfmittelmischung (in verschiedenen Verhältnissen wie folgt gemischt: 1:9). , 3:7, 5:5, 7:3 und 9:1). B, C Unterschiedliche Buchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten an (± SEM; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05; drei unabhängige Experimente).

Da die konkurrierende Knöllchenbildung zwischen kommerziellen Rhizobien-Impfmitteln und einheimischen Rhizobien ein lang anhaltendes Problem in der landwirtschaftlichen Praxis darstellt [83], wurden diese Mutanten weiter auf ihre Fähigkeit zur Knöllchenbesetzung an in Vermiculit gewachsenen Pflanzen getestet. Der Wildtyp SF2 kann auf vielen wilden Sojabohnenakzessionen und einigen Sojabohnenlandrassen wirksame Knötchen bilden, jedoch nicht auf bestimmten modernen Sojabohnensorten [67, 84]. Als diese Mutanten auf wilde Sojabohnenpflanzen geimpft wurden, zeigte nur die exoB-Mutante signifikante Mängel in der Knötchenbildung und der symbiotischen Leistung hinsichtlich des Trockengewichts der Triebe (Tabelle S4). Darüber hinaus wurde die exoB-Mutante im kompetitiven Nodulationsexperiment durch SF2 vollständig verdrängt (Inokulationsverhältnis 1:1; Abb. 3B). Die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten zeigten ebenfalls einen signifikanten Defekt in der Knötchenbelegung (13–17 %; Abb. 3B), während nur exoK unter den anderen Exo-Mutanten in geringerem Maße eine beeinträchtigte Knötchenbelegung aufwies (36 %). . Die fadL- ​​(78 %) und exoZ-Mutanten (63 %) besetzten mehr Knötchen als SF2. Da die exoY-, exoA-, exoZ- und exoK-Mutanten hinsichtlich der Rhizoplane-Kolonisierung auf wilden Sojabohnenpflanzen alle nicht von SF2 zu unterscheiden waren (Abb. 3A), ist die Rolle von ExoZ und ExoK bei der kompetitiven Nodulation möglicherweise nicht auf ihre vorhergesagten Funktionen bei der EPS-Modifikation zurückzuführen Abbau [73, 85].

Wir haben zuvor berichtet, dass Mutationen in rhcV, das eine wesentliche Komponente des Typ-3-Sekretionssystems in SF2 kodiert, eine verbesserte Knotenbildung und symbiotische Leistung bei bestimmten kommerziellen Sojabohnensorten wie JD17 ermöglichen (84, 86). Als fadL im Hintergrund der rhcV-Mutante weiter mutiert wurde, zeigte die rchV-fadL-Doppelmutante eine höhere Knotenbelegung (61 %) als die rhcV-Mutante auf JD17 (Abb. 3B; p < 0,01). Wir haben die Auswirkungen der fadL-Mutation weiter in einem Modellstamm SM2011 (87) und einem Impfstamm SM01290 (88) von S. meliloti im Zusammenhang mit Luzerne getestet. Diese beiden fadL-Mutanten besetzten mehr Knötchen als ihre Wildtyp-Stämme SM2011 und SM01290 (Abb. 3B; 74–78 %; p-Werte < 0,001). Insgesamt stimmte die unterschiedliche Knötchenbesetzungsfähigkeit zwischen der fadL-Mutante und den exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten mit ihrer entgegengesetzten Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit überein.

Um potenzielle Merkmale aufzudecken, die mit der kontrastierenden Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit von Testmutanten (Abb. 2 und Abb. 3A), ihren Wachstumskurven (Abb. S4A), der EPS-Produktion (Abb. S4B) und der Biofilmbildung (Abb. S4C) verbunden sind. , Schwimmen und Oberflächenmotilität (Abb. 4A – C) wurden verglichen. Die exo- und fadL-Mutanten unterschieden sich in ihren Wachstumskurven im TY-reichen Medium nicht signifikant voneinander (Abb. S4A). Alle Exo-Mutanten mit Ausnahme von exoZ produzierten weniger EPS (sowohl Zusammensetzungen mit hohem als auch niedrigem Molekulargewicht; Abb. S4B), was mit ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung übereinstimmte (Abb. S4C). Diese Ergebnisse stützen die Ansicht, dass EPS wichtige Matrixbestandteile des Biofilms sind [25]. Bemerkenswerterweise waren die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten nicht von den anderen Exo-Mutanten außer exoZ zu unterscheiden, und die fadL-Mutante hatte eine ähnliche Fähigkeit zur EPS-Produktion und Biofilmbildung wie SF2 (Abb. S4B, C). Anscheinend konnten diese Eigenschaften von Wachstumskurven, EPS und Biofilmproduktion die beobachtete Variation in der Rhizoplane-Kolonisierungskompetenz der fadL- ​​und Exo-Mutanten nicht erklären (Abb. 2 und Abb. 3A). Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass der Biofilm die „Heimat“ mehrerer Zellen ist [25], von denen einige Familienmitglieder (wie bestimmte Exo-Mutanten) Rhizoplane effektiv mit anderen EPS-Produzenten in der Wurzelmikrobiota co-kolonisieren können.

Angesichts der wichtigen Rolle der Motilität bei der Migration zu Wurzeln wurden das Schwimmen und die Oberflächenmotilität der Testmutanten verglichen (Abb. 4A – C). Der fadL-Mutant hatte eine höhere Oberflächenmotilitätsfähigkeit als SF2 (Abb. 4C; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05). Alle Exo-Mutanten zeigten eine geringere Oberflächenmotilität im Hinblick auf den Durchmesser der Kolonien auf der halbfesten Platte (0,5 % Agar mit Kongorot; Abb. 4C), während die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten deutliche radiale Risse in ihren Kolonien aufwiesen (gekennzeichnet durch * in Abb. 4A), die bei den anderen Exo-Mutanten nicht beobachtet wurden (Abb. 4A). Die Variation in der Schwimmfähigkeit der Testmutanten stimmte jedoch nicht mit ihrer Fähigkeit zur Rhizoplane-Kolonisierung überein (Abb. 4B). Um die gegensätzlichen Oberflächenmotilitätsphänotypen weiter zu verifizieren, wurden die GFP-markierten SF2- und mCherry-markierten fadL- ​​oder exoF-Mutanten in unterschiedlichen Verhältnissen 1:9, 3:7, 5:5: 7:3 und 9:1 gemischt (Abb. 4D). ) und die höhere bzw. geringere Oberflächenmotilitätsfähigkeit der fadL- ​​bzw. exoF-Mutante wurde über alle Inokulationsverhältnisse hinweg nachgewiesen. Die Oberflächenmotilitätsfähigkeit der fadL-, exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten kann in ihren entsprechenden komplementären Mutantenstämmen vollständig wiederhergestellt werden (Abb. S5).

Die verfügbare Literatur legt nahe, dass die Oberflächenmotilität auf der halbfesten Testplatte (0,5 % Agar) ein Flagellum-abhängiges Schwärmen und/oder Flagellum-unabhängige Motilitätsprozesse sein kann, z. B. Pilus-abhängiges Zucken, Adhäsin-abhängiges Gleiten und Gleiten, angetrieben durch den Wachstumsdruck Zellen und wird durch zusätzliche Faktoren (z. B. Tensid, EPS und Oberflächenprotein) auf art- und ressourcenabhängige Weise erleichtert [89, 90]. In dieser Arbeit wurden keine bekannten Gene für Flagellum, Pilus oder Adhäsin in der Liste der Rhizoplane-Fitnessgene für breite Wirte gefunden (Abb. S2 und Daten S2.2). Als beispielsweise vier flaA-Gene, die für Flagellenfilament-Untereinheiten kodieren, gelöscht wurden (Abb. S6A), zeigte die resultierende flaA-Mutante erwartungsgemäß eine beeinträchtigte Flagellum-abhängige Schwimmfähigkeit (TY-Platten mit 0,3 % Agar; Abb. S6B–D; p < 0,01). ), war jedoch hinsichtlich der Oberflächenmotilität (TY-Platten mit 0,5 % Agar; Abb. S6B, D) und im Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeitstest (Abb. S7) nicht von SF2 zu unterscheiden. Kurz gesagt, die Variation der Oberflächenmotilität, wahrscheinlich Gleiten und/oder andere unbekannte Bewegungsmechanismen, stimmte mit der entgegengesetzten Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit zwischen der fadL-Mutante und den exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten überein.

Die oben genannten Beweise (Abb. 2–4) deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Oberflächenmotilität und der kompetitiven Rhizoplane-Besiedlung hin. Hier untersuchten wir weiter die Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit einzelner Mutanten von fadL, exoF, exoP und exoQ, wobei die Stämme exoY, exoA und SF2 als Kontrollen dienten. Die fadL-Mutante zeigte eine signifikant höhere Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit auf wilden Sojabohnen, kultivierten Sojabohnen, Reis und Mais, während die exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten, jedoch nicht die exoA- und exoY-Mutanten, eine signifikante Beeinträchtigung der Rhizoplane-Kolonisierung zeigten (Abb. 5A). ; p-Werte < 0,001). Im Gegensatz dazu zeigten diese Mutanten in Abwesenheit von Pflanzen eine ähnliche Überlebensfähigkeit auf dem Filterpapier der Kulturschale (Abb. 5A; p > 0,05). Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) auf der Rhizoplane zeigte ein globales wirtsabhängiges Muster (Abb. 5A), was mit der Variation der Wurzelexsudate verschiedener Pflanzenarten [20] und ihren Auswirkungen auf die Zusammensetzung des Wurzelmikrobioms übereinstimmt [21]. Dennoch war die entgegengesetzte Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit zwischen der fadL-Mutante und den exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten nicht wirtsabhängig. Daher wurden die folgenden Experimente zu Rhizosphäreneffekten nur an einer Pflanzenart (wilde Sojabohne) durchgeführt.

Eine Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit einzelner Stämme. F Filter ohne Pflanzen, WS wilde Sojabohne, CS kultivierte Sojabohne, R Reis, Z Mais. B Rhizoplane-Überlebensfähigkeit einzelner Stämme auf WS-Wurzeln bei 7 dpi (Tage nach der Inokulation). Zum Vergleich wurden Proben mit 1 hpi (Stunden nach der Inokulation) verwendet. Es wird ein signifikanter Unterschied zum Wildtyp-Stamm SF2 (WT) angezeigt (t-Test; ***, p < 0,001). Fehlerbalken stellen die SD von drei biologischen Replikaten dar (bei diesen kleinen SD-Werten nicht sichtbar).

Die beobachtete Variation der Besiedlungsraten der Rhizoebene (Abb. 2, Abb. 3 und Abb. 5A) kann die Überlebensfähigkeit in der Rhizosphäre und auf der Rhizoebene sowie die Migration von der Rhizosphäre zur Rhizoebene betreffen, was jedoch in veröffentlichten Tn-seq-Studien nicht ausreichend berücksichtigt wurde von Rhizoplane-Kolonisierungsgenen [13,14,15,16,17,18]. Die Test-Exo- und fadL-Mutanten zeigten keinen Wachstumsdefekt im TY-reichen Medium (Abb. S4A) und keinen Überlebensdefekt auf Filterpapier von Pflanzenkulturschalen (Abb. 5A), es blieb jedoch unklar, ob dies auch auf Rhizoplane zutreffen würde. Um diese Frage zu beantworten, wurden die Wurzeln der Sämlinge einzeln mit Teststämmen inokuliert, bevor sie in Kulturschalen gepflanzt wurden (Abb. 5B). Die Anzahl der KBE auf Rhizoplane bei 7 dpi war für die fadL-Mutante im Vergleich zu den anderen Teststämmen (SF2, exoY, exoA, exoQ, exoF und exoP; p-Werte < 0,001) signifikant höher, während dies bei den Exo-Mutanten und SF2 nicht der Fall war deutlich voneinander unterscheiden (Abb. 5B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Überlebensfähigkeit der Rhizoplane zumindest teilweise für die überlegene Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit der fadL-Mutante verantwortlich ist, jedoch nicht mit Kolonisierungsdefekten der exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten korreliert.

Diese Ergebnisse werfen ferner die Frage auf, ob sowohl Überlebensfähigkeit als auch Oberflächenmotilität die Rhizosphärenprozesse sind, die den unterschiedlichen Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeiten der fadL-, exoF-, exoP- und exoQ-Mutanten zugrunde liegen. Um diese Frage zu beantworten, wurden die fadL- ​​oder exoF-Mutante und SF2 einzeln in symmetrischer Weise in einem Abstand von 1/2/3/4 cm von den Sämlingen entfernt (Abb. 6A). Die KBE an der Inokulationsstelle und auf der Rhizoebene wurden bei 7 dpi bestimmt. Bei allen Stämmen war die Anzahl der KBE auf der Rhizoplane umso geringer, je weiter die Impfstelle von den Sämlingen entfernt war (Abb. 6B–E; graue Balken), was auf ein Abstands-Abnahmemuster für die Kolonisierungsraten der Rhizoplane hinweist. Dies liefert direkte Beweise für ein räumliches Muster der Effizienz der Bakterien-Wurzel-Interaktion, das in verschiedenen Modellen von Rhizosphäreneffekten als selbstverständlich angesehen, aber selten getestet wird (19, 20, 91). An Standorten von 1–4 cm zeigten diese beiden Mutanten keinen signifikanten Unterschied in der Überlebensfähigkeit im Vergleich zu SF2 (Abb. 6B, C; p-Werte > 0,05). Unabhängig von der Überlebensfähigkeit an diesen Standorten hatten die fadL- ​​und exoF-Mutanten höhere (153–223 % mehr KBE als SF2; p-Werte < 0,001; graue Balken im linken Feld von Abb. 6B) und niedrigere (75–98 % weniger KBE als SF2; p-Werte < 0,001; graue Balken im linken Feld von Abb. 6C) Rhizoplane-Besiedlungsraten im Vergleich zu SF2 (graue Balken im rechten Feld von Abb. 6B, C). Alle mit diesen beiden Mutanten verbundenen Rhizosphären-Phänotypen können in ihren entsprechenden komplementären Mutantenstämmen wiederhergestellt werden (Abb. 6D, E). Diese Ergebnisse stimmen mit ihrer kontrastierenden Oberflächenmotilitätsfähigkeit überein (Abb. 4 und Abb. S5). Insgesamt wird die Variation der Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit zwischen den fadL- ​​und exoF-Mutanten und SF2 hauptsächlich durch ihre Oberflächenmotilität im Migrationsprozess von der Rhizosphäre zur Rhizoplane moduliert.

AA schematische Übersicht, die den Rhizosphären-Überlebenstest des Wildtyp-SF2 (WT; grün) und seiner Derivate (rot) zeigt, die symmetrisch in 1 cm, 2 cm, 3 cm und 4 cm Entfernung von den Wurzeln inokuliert wurden. B–E Koloniebildende Einheiten (KBE) von den Inokulationsstellen (Filter) und der Rhizoplane (Wurzel) wurden bei 7 dpi (Tage nach der Inokulation) getestet. Es wird ein signifikanter Unterschied zum WT angezeigt (t-Test; ***, p < 0,001). Fehlerbalken stellen die SD von drei biologischen Replikaten dar.

Die verfügbaren Beweise deuten darauf hin, dass das Homolog des langkettigen Fettsäuretransporters FadL in S. meliloti die Aufnahme von langkettigem AHL (mit Acylketten mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen) fördern kann [92] und langkettige AHLs als unterstützende Biotenside fungieren können Oberflächenmotilität von Rhizobium etli auf der halbfesten Platte (Hefeextrakt-Mannit-Medium mit 0,75 % Agar) [93]. Eine direkte Messung der AHL-Mischung aus der fadL-Mutante war jedoch noch nicht möglich. Wir untersuchten daher den extrazellulären Gehalt an AHLs in SF2, Mutanten von fadL und exo und ihren komplementären Mutantenstämmen unter Verwendung eines AHL-Indikatorstamms A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) [46] (Abb. 7A). Dieser Indikatorstamm, dem die Fähigkeit zur AHL-Biosynthese fehlt, überexprimiert den AHL-Rezeptor TraR, der die Expression der PtraI-lacZ-Fusion bei Interaktion mit AHL-Molekülen verschiedener Kettenlängen, Sättigungsgrade und Oxidationsstufen aktivieren kann [46]. Auf der Oberflächenmotilitätsplatte sorgte die fadL-Mutante dafür, dass A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) mehr β-Galactosidase als SF2 exprimierte (Abb. 7B) und somit mehr X-Gal in das blaue Produkt spaltete (Abb. 7A). ). Im Gegensatz dazu wiesen die exoQ-, exoF- und exoP-Mutanten einen verringerten Spiegel an extrazellulären AHLs auf und die exoY- und exoA-Mutanten ähnelten SF2 (Abb. 7A, B). Die erhöhten und verringerten Mengen an extrazellulären AHLs aus den fadL- ​​und exoF/exoP/exoQ-Mutanten können in ihren komplementären Mutantenstämmen unter Testbedingungen wiederhergestellt werden (Abb. 7A, B). Nach unserem Kenntnisstand [72,73,74,75,76,77, 94] könnte dies der erste Bericht über die Beteiligung des EPS-Sekretionssystems an der Modulation extrazellulärer AHLs sein.

A Nachweis von extrazellulären AHLs aus Rhizobien (zentrale Kolonie) mit dem Biosensor A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) (Kreis) auf der TY-Platte (0,5 % Agar, Kongorot und X-Gal). B β-Galactosidase-Aktivität von A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)-Zellen, gesammelt aus (A). C Intra- und extrazelluläre AHL-Konzentrationen, bestimmt mit dem HPLC-Q-Exactive-PRM-MS-Ansatz. NF, nicht gefunden. DA-Arbeitsmodell für den Transport lang- und kurzkettiger AHLs durch in Membranen integriertes FadL und ExoFPQ. Es wird eine vorhergesagte Unterdrückung der Biosynthese langkettiger AHLs durch kurzkettige AHLs gezeigt. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Mittelwerten wird in (B) (*, p < 0,05; ***, p < 0,001; t-Test) und (C) (verschiedene Buchstaben in Klammern; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05) angegeben. basierend auf drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken repräsentieren SEM (B) oder SD (C).

Um weitere Einblicke in die Mischung von AHLs zu erhalten, die mit den fadL- ​​und exoF-Mutanten assoziiert sind, wurden intra- und extrazelluläre AHLs mithilfe des HPLC-Q-Exactive-PRM-MS-Ansatzes bestimmt (Abb. 7C). Eine kleine Menge eines kurzkettigen AHL 3-OXO-C8-HSL wurde im exoF-Mutanten nachgewiesen, war jedoch in den Zellen der anderen Teststämme nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde für die exoF-Mutante kein extrazelluläres 3-OXO-C8-HSL nachgewiesen, wohl aber für die anderen Stämme, unter denen der komplementäre Mutantenstamm der exoF-Mutante mehr extrazelluläres 3-OXO-C8-HSL als SF2 aufwies (ANOVA). gefolgt von Duncans Test, Alpha = 0,05). Die exoF-Mutante war auch durch ihre niedrigeren intrazellulären (3-OXO-C12-HSL, 3-OXO-C14-HSL und C14-HSL) und extrazellulären langkettigen AHLs (3-OXO-C12-HSL, C12-HSL) gekennzeichnet , 3-OXO-C14-HSL und C14-HSL; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05) als SF2. Sein komplementärer Mutantenstamm hatte höhere extrazelluläre langkettige AHLs als SF2 (C12-HSL, 3-OXO-C14-HSL und C14-HSL; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05), während er in seinen intrazellulären Eigenschaften nicht von SF2 zu unterscheiden war langkettige AHLs. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf ein Modell hin, bei dem ExoF für die Sekretion des kurzkettigen AHL 3-OXO-C8-HSL essentiell ist, dessen intrazelluläre Akkumulation in der exoF-Mutante zu einer Herunterregulierung der Biosynthese und des extrazellulären Niveaus von langkettigem AHL führen kann. Ketten-AHLs (Abb. 7D). Frühere Bemühungen zeigen, dass ein Multidrug-Effluxsystem MexAB-OprM aus P. aeruginosa an der aktiven Sekretion langkettiger AHLs beteiligt ist und dass das BpeAB-OprB-Effluxsystem aus Burkholderia pseudomallei für die Sekretion von AHLs unterschiedlicher Länge erforderlich ist [95, 96]. ]. Es wurde angenommen, dass die kurzkettigen AHLs in anderen Bakterien frei durch Membranen diffundieren [97]. Anscheinend verdient diese seit langem bestehende Hypothese zur passiven Diffusion von AHLs, insbesondere für diese kurzkettigen AHLs, ausführlichere Untersuchungen.

In S. fredii sind die traI- und sinI-Gene für die Biosynthese kurz- bzw. langkettiger AHLs essentiell [98]. Tatsächlich wurde in den traI- und traI-exoF-Mutanten von SF2 kein 3-OXO-C8-HSL nachgewiesen (Abb. 8A). Die abgereicherten Mengen an intrazellulären (1,7–4,6 % von SF2) und extrazellulären (25,9–57,4 % von SF2) langkettigen AHLs der exoF-Mutante (Abb. 7C) wurden durch weitere Deletion von traI (Abb. 8A; 58,9) erheblich wiederhergestellt –87,7 % bzw. 79,6–85,4 % für intrazelluläre bzw. extrazelluläre langkettige AHLs). Darüber hinaus akkumulierte der traI sinI-Doppelmutant, der keine endogenen AHLs produzieren konnte (Abb. 8A), in Gegenwart von 100 ng/ml exogenem 3-OXO-C8 weniger intrazelluläres 3-OXO-C8-HSL als der traI sinI exoF-Dreifachmutant -HSL (Abb. 8B). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die wichtige Rolle von ExoF bei der Sekretion kurzkettiger AHLs und dass die intrazelluläre Akkumulation kurzkettiger AHLs die Biosynthese langkettiger AHLs negativ moduliert (Abb. 7D).

A Intra- und extrazelluläre AHL-Konzentrationen, bestimmt mit dem HPLC-Q-Exactive-PRM-MS-Ansatz. NF nicht gefunden. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten (±SD, drei unabhängige Experimente) basierend auf ANOVA gefolgt von Duncan-Test hin, Alpha = 0,05. B Intrazelluläre kurzkettige AHLs von TraI-sinI- und traI-sinI-exoF-Mutanten in Gegenwart von 100 ng/ml exogenem 3-OXO-C8-HSL. C Intrazelluläre langkettige AHLs von TraI-sinI- und traI-sinI-fadL-Mutanten in Gegenwart von 100 ng/ml exogenem 3-OXO-C14-HSL. D–F Exogene langkettige AHLs verbessern die Fähigkeit der Rhizobien zur Wurzelwanderung (2 μl langkettige AHL-Lösung, enthaltend 45 ng 3-OXO-C12-HSL, 52 ng C14-HSL und 1 μg 3-OXO-C14-HSL). , gemäß der extrazellulären AHL-Zusammensetzung, die aus der fadL-Mutante in Abb. 7C nachgewiesen wurde. DA schematischer Überblick über den Versuchsaufbau, der die Inokulation von Rhizobien (WT/Mutanten) und AHLs (oder 0,8 % NaCl als Negativkontrolle) in symmetrischen Abständen zur Wurzel zeigt. E, F Langkettige AHLs verstärken die Rhizoplane-Kolonisierung durch WT (E), die TraI-SinI- und ExoF-Mutanten (F). Signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten (± SEM, drei unabhängige Experimente) werden in (B–F) angezeigt (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; t-Test).

Im Gegensatz dazu hatte die fadL-Mutante im Vergleich zu SF2 einen ähnlichen intrazellulären AHL-Spiegel, war jedoch durch die höchsten extrazellulären langkettigen AHLs gekennzeichnet (Abb. 7C; ANOVA gefolgt von Duncan-Test, Alpha = 0,05). Die intra- und extrazellulären Spiegel des kurzkettigen AHL 3-OXO-C8-HSL waren zwischen der fadL-Mutante und SF2 ähnlich. Der extrazelluläre Spiegel langkettiger AHLs der fadL-Mutante kann in ihrem komplementären Mutantenstamm wiederhergestellt werden (Abb. 7C). Darüber hinaus zeigte die TraI sinI fadL-Dreifachmutante einen signifikanten Defekt in der 3-OXO-C14-HSL-Aufnahme im Vergleich zur TraI sinI-Doppelmutante in Gegenwart von 100 ng/ml exogenem 3-OXO-C14-HSL (Abb. 8C). Diese Ergebnisse liefern aufschlussreichere Beweise, die die Hypothese von FadL als Aufnahmesystem für langkettige AHLs stützen [92] (Abb. 7D).

Offenbar stimmen die gegensätzliche Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit und Oberflächenmotilität zwischen den fadL- ​​und exoF-Mutanten sowie SF2 mit ihren Variationen in der Mischung extrazellulärer AHLs überein. Es wurde gezeigt, dass langkettige AHLs als Biotenside fungieren können, die die Oberflächenmotilität von R. etli fördern [93]. Wir fragten uns, ob eine synthetische Mischung, die die extrazelluläre Zusammensetzung von AHLs aus der fadL-Mutante nachahmt, die Oberflächenmotilität und die Rhizoplane-Kolonisierungsraten von SF2 und seinen verschiedenen Mutanten verbessern würde. So wurden 3-OXO-C12-HSL (4,0 %), 3-OXO-C14-HSL (91,3 %) und C14-HSL 3 (4,7 %) synthetisiert und als Gemisch von AHLs gemischt. Auf der halbfesten TY-Platte (0,5 % Agar) verbesserte diese Mischung von AHLs die Oberflächenmotilität von SF2-, flaA-, exoF- und traI sinI-Mutanten deutlich (Abb. S8; p-Werte < 0,001). Die exoF-, traI sinI- und sinI-Mutanten (p-Werte < 0,001), nicht jedoch die flaA- und traI-Mutanten, zeigten in den symmetrischen Inokulationsexperimenten beeinträchtigte Wurzelbesiedlungsraten (Abb. S7 und Abb. 6). Wenn die synthetisierte Mischung langkettiger AHLs symmetrisch als SF2, traI sinI und exoF im gleichen Abstand zu den Wurzeln inokuliert wurde (Abb. 8E, F), waren die Rhizoplane-Kolonisierungsraten dieser Stämme im Vergleich zur 0,8 % NaCl-Kontrolle deutlich erhöht (p-Werte < 0,05). Dieser Diffusionseffekt langkettiger AHLs war in einer Entfernung von 1 cm, 2 cm, 3 cm oder 4 cm von den Wurzeln nachweisbar (Abb. 8E, F). Darüber hinaus kann diese AHL-Mischung auch die Überlebensfähigkeit von SF2 an 1 cm- und 2 cm-Standorten deutlich verbessern (Abb. S9; p-Werte < 0,001). In ähnlicher Weise kann die fadL-Mutante auch die Überlebensfähigkeit von SF2 verbessern, wenn diese beiden Stämme symmetrisch auf beiden Seiten der Sämlinge inokuliert wurden (Abb. 6B), obwohl die fadL-Mutante, die extrazelluläre langkettige AHLs überproduziert, bei der Rhizoplane-Kolonisierung überlegen war . Bemerkenswerterweise zeigte die sinI-Mutante, die nicht in der Lage war, langkettige AHLs zu produzieren (Abb. 8A), im symmetrischen Inokulationsexperiment eine beeinträchtigte Besiedlungsrate der Rhizoebene (Abb. S7), wohingegen reichlich sinI-Mutanten auf der Rhizoebene der Testpflanzen in der Tn-Pflanze identifiziert wurden. seq-Bildschirm (Abb. S10). Das Tn-seq-Ergebnis stimmte damit überein, dass die sinI-Mutante hinsichtlich der Rhizoplane-Kolonisierungsrate genauso konkurrenzfähig war wie SF2 (sinI vs. SF2 = 52 % vs. 48 %; p > 0,05), wenn sie als 1:1-Mischung inokuliert wurden. In Übereinstimmung mit diesen Rhizoplane-Kolonisierungsexperimenten zeigten die sinI- oder traI-sinI-Mutanten im Vergleich zu SF2 und der traI-Mutante eine beeinträchtigte Oberflächenmotilität (Abb. S10B; p-Werte < 0,001). Dieser Oberflächenmotilitätsdefekt kann jedoch behoben werden, wenn sie mit SF2 gemischt werden (Abb. S10C). Daher war der Rhizoplane-Kolonisierungsdefekt des sinI-Mutanten nicht so signifikant wie der des Mutanten ohne multifunktionales ExoF in einer Impfmischung, die den Wildtyp-SF2 enthielt.

Die Entwicklung des Wurzelmikrobioms für eine nachhaltige Landwirtschaft steckt noch in den Kinderschuhen, was größtenteils auf das begrenzte Verständnis der Mechanismen zurückzuführen ist, die dem Aufbau des Wurzelmikrobioms zugrunde liegen [20]. Den Rhizoplane-Kolonisierungsmechanismen von Schlüsselarten der Wurzelmikrobiota wird zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt. Jüngste genomweite Tn-seq-Analysen von Pionieren zeigen mehr Rhizoplane-Fitnessgene [13, 14, 15, 16, 17, 18], deren Funktionen im Migrationsprozess von der Rhizosphäre zur Rhizoplane noch nicht ausreichend untersucht wurden. Diese Arbeit konzentrierte sich auf eine wichtige nützliche Art, S. fredii, und führte eine genomweite Tn-seq-Untersuchung ihrer Gene durch, die die Rhizoplane-Kolonisierung auf wilden Sojabohnen, kultivierten Sojabohnen, Reis und Mais entweder positiv oder negativ modulieren (Abb. 1). Es wurde eine robuste Liste von Kolonisierungsgenen mit breitem Wirtsbereich identifiziert (Abb. S2). Anschließend konzentrierten wir uns auf herausragende fadL und exoF/exoQ/exoP mit negativen bzw. positiven Rollen bei der Rhizoplane-Kolonisierung in einem breiten Wirtsbereich (Abb. 2 und Abb. 3). Reverse-genetische Charakterisierungen dieser vier Gene und verwandter Exo-Gene, die an der EPS-Biosynthese und dem EPS-Abbau beteiligt sind, legen nahe, dass die kontrastierende Rhizoplane-Kolonisierungsfähigkeit durch die Oberflächenmotilität von Rhizosphäre zu Rhizoplane und nicht durch Schwimmen sowie durch die Überlebensfähigkeit von Rhizosphäre und Rhizoplane vermittelt wird (Abb. 3 – Abb. 6 und Abb. S4 – S6). Mit weiteren physiologischen Analysen der Quorum-Sensing-AHLs dieser Stämme (Abb. 7–8) haben wir gezeigt, dass FadL die Aufnahme langkettiger AHLs vermittelt, während ExoF wahrscheinlich die Sekretion kurzkettiger AHLs vermittelt, und dass die Akkumulation kurzkettiger AHLs vermittelt. Ketten-AHLs in Zellen der exoF-Mutante können zu einer Herunterregulierung der Biosynthese und einem niedrigeren extrazellulären Niveau langkettiger AHLs führen (Abb. 7D). Daher stimmen die unterschiedlichen extrazellulären Spiegel langkettiger AHLs zwischen den fadL- ​​und exoF-Mutanten sowie SF2 mit der Variation ihrer Rhizoplane-Kolonisierungsraten überein. Die entscheidende Rolle langkettiger AHLs im Migrationsprozess von der Rhizosphäre zur Rhizoebene wurde weiter durch den Diffusionseffekt einer synthetischen Mischung langkettiger AHLs bestätigt, die die des fadL-Mutanten nachahmt (Abb. 8E, F). Angesichts der weiten Verbreitung von FadL- und ExoFQP-Homologen in Alphaproteobakterien (Abb. S11) kann die durch FadL-ExoFQP vermittelte Regulierung der Oberflächenmotilität bei der Migration zu Wurzeln ein evolutionär konservierter Gen-Nischen-Interaktionsmechanismus sein. Es prägt das „Heimleben“ der Rhizobakterien, die zu dieser Klasse gehören, zu der verschiedene Schlüsselarten des Wurzelmikrobioms gehören. Das in dieser Arbeit entwickelte Verfahren kann auch in Studien zu anderen Bakterien-Wirt-Interaktionen eingesetzt werden. Diese Arbeit und andere veröffentlichte Hochdurchsatzstudien zu Rhizoplane-Fitnessgenen beschränken sich immer noch auf die bekannten Schlüsselarten unter gut kontrollierten Laborbedingungen. Obwohl die ökologischen Rollen dieser Schlüsselarten bei der Interaktion zwischen Boden, Pflanze und Mikrobiota intensiv untersucht wurden, wurden die Funktionen von Rhizoplane-Fitnessgenen unter komplizierten und schwankenden Bodenbedingungen, die intensiv und dynamisch mit Pflanzen und Mikrobiota interagieren, selten weiter getestet. Im Gegensatz zur schnellen Kumulierung metagenomischer Daten im Zusammenhang mit der Wurzelmikrobiomforschung sind unsere Bemühungen zur funktionellen Charakterisierung noch begrenzt, und Werkzeuge zur funktionellen Genomik mit hohem Durchsatz (z. B. Tn-seq) sollten weiter verbessert und unter verschiedenen Bodenbedingungen erforscht werden.

Auf Rohsequenzdaten aus unserer Tn-seq-Analyse kann über das NCBI Sequence Read Archive (PRJNA808870) zugegriffen werden.

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Wir danken Prof. Zengtao Zhong von der Nanjing Agricultural University und Prof. Hongli Yuan von der China Agricultural University für die Weitergabe und Bereitstellung von A. tumerfaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410). Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Fördernummer 2019YFA09004700), der National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 32070078), dem Innovative Project of State Key Laboratory of Agrobiotechnology (Fördernummer 2020SKLAB1-5) und dem unterstützt 2115 Talententwicklungsprogramm der China Agricultural University.

Staatliches Schlüssellabor für Agrarbiotechnologie und Hochschule für Biowissenschaften, China Agricultural University, Peking, China

Yuan-Yuan Ji, Biliang Zhang, Pan Zhang, Liu-Chi Chen, You-Wei Si, Xi-Yao Wan, Can Li, Ren-He Wang, Yu Tian, ​​Ziding Zhang und Chang-Fu Tian

MOA Key Laboratory of Soil Microbiology und Rhizobium Research Center, China Agricultural University, Peking, China

Yuan-Yuan Ji, Biliang Zhang, Pan Zhang, Liu-Chi Chen, You-Wei Si, Xi-Yao Wan, Can Li, Ren-He Wang, Yu Tian und Chang-Fu Tian

Shenzhen Institute of Synthetic Biology (iSynBio) Shenzhen Institute of Advanced Technology (SIAT), Chinesische Akademie der Wissenschaften, 518055, Shenzhen, China

Pan Zhang

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CFT hat das Projekt konzipiert. CFT und YYJ haben die Forschung entworfen. YYJ führte alle Experimente mit Beitrag von PZ, LCC, YWS, XYW, CL, RHW und YT durch. YYJ und BLZ analysierten Tn-seq-Daten mit Beitrag von ZZ. CFT und YYJ haben das Papier vorbereitet. CFT hat das Papier überprüft und bearbeitet. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Chang-Fu Tian.

Die China Agricultural University hat eine vorläufige Patentanmeldung eingereicht, die Aspekte der landwirtschaftlichen Anwendung der fadL-Mutanten umfasst, bei denen CFT und YYJ als Erfinder aufgeführt sind.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ji, YY., Zhang, B., Zhang, P. et al. Rhizobienmigration zu Wurzeln, vermittelt durch FadL-ExoFQP-Modulation extrazellulärer langkettiger AHLs. ISME J 17, 417–431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

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Eingegangen: 02. März 2022

Überarbeitet: 28. Dezember 2022

Angenommen: 04. Januar 2023

Veröffentlicht: 10. Januar 2023

Ausgabedatum: März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

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Mikrobiom (2023)