Trocken konservierte mehrschichtige Fibroblastenzellblätter sind ein neues handhabbares Werkzeug für die regenerative Medizin zur Förderung der Wundheilung

Apr 03, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12519 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Diese Studie untersuchte die therapeutischen Wirkungen trocken konservierter mehrschichtiger Fibroblasten-Zellschichten (Trockenschichten) auf Hautgeschwüre. Trockene Blätter wurden durch Lufttrocknung mehrschichtiger Fibroblasten-Zellblätter (lebende Blätter) hergestellt, um ihre Lebensaktivitäten einzustellen. Vor der In-vivo-Anwendung testeten wir die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in das Medium, um die Mechanismen trockener Blätter bei der Wundheilung zu untersuchen. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und der Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurden sowohl aus trockenen als auch aus lebenden Blättern freigesetzt, während hohe Mengen an Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) und Protein der Gruppe 1 mit hoher Mobilität (HMGB1) nur aus freigesetzt wurden trockene Laken. Ein In-vitro-Fibroblastenproliferationstest ergab, dass das trockene Blatteluat im Vergleich zum lebenden Blatteluat die Zellproliferation und die VEGF- und HGF-Produktion deutlich steigerte. FGF-2-neutralisierende Antikörper blockierten diese proliferative Reaktion deutlich. Bei Wunden, die bei diabetischen Mäusen entstanden waren, zeigten die Gruppen, die mit Trockenfolien behandelt wurden und autologe oder allogene Zellen verwendeten, im Vergleich zu denen in der Gruppe ohne Behandlung einen signifikant beschleunigten Wundverschluss. Die Lagerstabilität des trockenen Blattes war bei Kühltemperatur besser als bei Raumtemperatur und blieb mindestens 4 Wochen lang stabil. Unsere Daten zeigten, dass allogene Trockentücher ein vielversprechendes neues Instrument für die regenerative Medizin darstellen, das die Wundheilung fördert.

Kürzlich wurde die Zellblatttechnologie entwickelt, um die Retention transplantierter Zellen in der transplantierten Region zu verbessern1, und die Zellblatttransplantationstherapie wurde zur Vorbeugung verschiedener Krankheiten und postoperativer Komplikationen eingesetzt, darunter ischämische Kardiomyopathie, Luftleckage nach Lungenoperationen und Stenose nach endoskopischer Submukosa Dissektion der Speiseröhre2,3,4. Diese Technik kann auch zur Behandlung von Hautgeschwüren eingesetzt werden.

Zuvor haben wir eine gemischte Zellschicht aus Fibroblasten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) entwickelt, die die Sekretion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) aus Fibroblasten durch die synergistischen Effekte der Kokultivierung mit PBMNCs und die Behandlung der hypoxischen Vorkonditionierung erhöhte5 ,6. Einer der Hauptwirkungsmechanismen für die therapeutische Wirkung von Zellschichten ist ein parakriner Effekt aufgrund der Produktion von Wachstumsfaktoren und Zytokinen aus den Zellschichten. Es wurde gezeigt, dass gemischte Zellschichten bei der Wundheilung bei Hautgeschwürmodellen von Mäusen und Kaninchen erfolgreich sind5,6. In unserer vorherigen Arbeit haben wir eine einfache Methode zur Herstellung mehrschichtiger Zellschichten entwickelt und über die Nützlichkeit autologer mehrschichtiger gemischter Schichten, die mit hypoxischer Vorkonditionierung behandelt wurden, in einem Maus-Hautgeschwürmodell berichtet7. Darüber hinaus wurden in einer klinischen Studie, in der eine hypoxische, vorkonditionierte, autologe, mehrschichtige gemischte Zellschicht, die PBMNCs und menschliche orale Schleimhautfibroblastenzellen enthielt, auf ein Beingeschwür transplantiert wurde, diese sicherheits- und wundheilungsfördernden Wirkungen bestätigt8. Drei der sechs Fälle führten jedoch nicht zu einer Transplantation: einer aufgrund eines fehlenden Fibroblastenzellwachstums, während die anderen beiden aufgrund einer schlechten VEGF-Produktion die Kriterien für eine Transplantation nicht erfüllten8. Diese klinische Studie mit autologen Zellen ergab auch eine hohe Rate schlechter Fibroblastenleistung der Patienten. Die Zellblatttherapie mit autologen Zellen ist eine vielversprechende Methode mit dem Potenzial, Patienten erfolgreich zu behandeln. Sie erfordert eine stabile Versorgung mit Zellblättern, die mit allogenen Zellen hergestellt wurden. Der Zweck autologer PBMNCs in den gemischten Zellschichten bestand darin, die Sekretionskapazität der Fibroblasten zu verbessern. Allerdings steigerte die Schichtung der Zellschichten die Funktion der Fibroblastenschichten ausreichend, und es gab kaum einen Unterschied zwischen den Auswirkungen von Fibroblasten allein und gemischten Zellschichten in einem Maus-Hautgeschwürmodell7. Wir bestätigten, dass ausreichend Wachstumsfaktoren von den mehrschichtigen Fibroblasten-Zellblättern sezerniert wurden und dass die wundheilende Wirkung allogener mehrschichtiger Fibroblasten-Zellblätter mit der autologer Zellblätter in einem Mäusegeschwürmodell vergleichbar war. Obwohl eine gewisse lokale Immunität auftritt, beeinträchtigt dies die Wundheilung nicht9. Wenn man also die klinische Anwendung der Zellblatttransplantationstherapie in Betracht zieht, könnten Zellblätter, die aus allogenen Zellen hergestellt werden, die stabil versorgt werden können, den besten Ansatz darstellen.

Um den Komfort und die Akzeptanz der Zellblatttherapie zu verbessern, wird es wichtig sein, eine einfache Methode zur Zellblattkonservierung zu entwickeln, die schnell angewendet werden kann. Eine Option ist die Verwendung von extrazellulären Matrix (ECM)-Blättern, die durch Einfrieren und Auftauen dezellularisiert werden10. Diese Folien haben den Vorteil der Lagerstabilität und einer geringeren Immunabstoßungsrate und dienen als Gerüst für Zellen bei der Transplantation10,11. Allerdings behalten sie aufgrund der Zellschädigung durch Frost-Tau-Wechsel nur wenig bioaktive Substanzen zurück. Ansonsten ist die Trockenkonservierung aus Komfortgründen die optimale Methode. Es wurden Studien an lyophilisierten Epidermiszellblättern12,13 und Amnionmembranblättern14,15 durchgeführt; Es liegen jedoch noch keine Berichte über trocken konservierte Fibroblastenblätter vor. Daher war es unser Ziel in dieser Studie, eine trocken konservierte mehrschichtige Fibroblastenzellschicht (Trockenschicht) zu entwickeln und ihre therapeutischen Wirkungen mithilfe allogener Fibroblasten in einem Hautgeschwürmodell der Maus zu bewerten. Um die Wirksamkeit der trockenen Blätter zu überprüfen, verglichen wir sie mit Gefrier-Tau-Blättern (FT-Blättern), die nach wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen fast keine Zellinhalte mehr enthalten, und mit mehrschichtigen Fibroblasten-Zellblättern (lebenden Blättern). Alle in dieser Studie verwendeten Zellschichten (lebende, trockene und FT-Schichten) wurden aus hypoxisch vorkonditionierten mehrschichtigen Fibroblastenzellschichten hergestellt, über die bereits berichtet wurde7, da eine hypoxische Vorkonditionierung die sekretorische Potenz der Fibroblasten wirksam erhöht5,6. Vor der In-vivo-Anwendung wurde die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in das Medium getestet, um die Wirkmechanismen trockener Blätter bei der Wundheilung zu untersuchen. Von den trockenen Blättern wird nicht erwartet, dass sie angiogene Faktoren wie VEGF und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) absondern, die von lebenden Blättern abgesondert werden. Das Trocknen kann jedoch zu einer Schädigung der Zellmembranen und zur Freisetzung intrazellulärer Substanzen bei der Rehydrierung führen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2)16,17,18,19,20 und das High Mobility Group Box 1 (HMGB1)-Protein21,22,23,24,25,26, die freigesetzt werden aus geschädigten Zellen und sind an der Wundheilung beteiligt. Wir untersuchten, ob diese Wachstumsfaktoren von den trockenen Schichten in das Medium abgegeben werden und ob sie ihre biologischen Aktivitäten behalten.

Kultivierte primäre Fibroblasten, die aus der Schwanzhaut von Mäusen stammen (C57BL/6N), wurden mit 4,2 × 105 Zellen pro Vertiefung in normale Kulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät, um eine mehrschichtige Zellschicht zu bilden, und dann wurden die Zellen unter normoxischen Bedingungen inkubiert (37). °C, 5 % CO2, 20 % O2) für 2 Tage, gefolgt von hypoxischen Bedingungen (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) für 1 Tag zur Behandlung der hypoxischen Vorkonditionierung5,6,7. Nach der Inkubation wurden die mehrschichtigen Fibroblastenzellblätter nach einer Dispase-Behandlung vorsichtig von den Kulturplatten abgelöst, um sie in dieser Studie als lebende Blätter zu verwenden. Wie in Abb. 1a gezeigt, wurden sowohl trockene Blätter als auch FT-Blätter aus lebenden Blättern durch 30-minütiges Lufttrocknen bzw. Gefrier-Tau-Zyklen hergestellt. Weitere Details finden Sie im Abschnitt „Material und Methoden“. Die morphologischen Beobachtungen jeder Zellschicht sind in Abb. 1b dargestellt. Das lebende Blatt schrumpfte nach der Ablösung von den Kulturplatten auf etwa die Hälfte seiner anhaftenden Größe. Das trockene Blatt war hart genug, um mit einer Pinzette gegriffen zu werden, behielt jedoch seine Struktur bei (ergänzende Abbildung S1). Das FT-Blatt war transparenter als das lebende Blatt.

Vorbereitung und histologische Analyse von Zellblättern. (a) Schematische Darstellung der Herstellung von mehrschichtigen Fibroblasten-Zellblättern, trocken konservierten mehrschichtigen Fibroblasten-Zellblättern und Gefrier-Auftau-(FT)-Blättern. (b) Morphologische Beobachtungen der lebenden, trockenen und FT-Blätter. Jedes Zellblatt wurde in eine Vertiefung der 24-Well-Platte gelegt (Maßstabsbalken = 5 mm). (c) Querschnitte der lebenden, trockenen und FT-Blätter mit HE-Färbung (Maßstabsbalken = 50 µm). (d) Querschnitte der lebenden, trockenen und FT-Blätter mit Azan-Färbung (Maßstabsbalken = 50 µm). (e) Querschnitte der lebenden, trockenen und FT-Blätter mit Immunfluoreszenzfärbung von Kollagen Typ I (rot) und DAPI (blau) (Maßstabsbalken = 50 µm). (f) Durchschnittliche Dicke jedes Zellblatts. Die Werte werden als Mittelwert ± SD (*P < 0,05, Tukey-Kramer-Test, n = 6 pro Gruppe) ausgedrückt. (g) Durchschnittliche Anzahl der Schichten in jedem Zellblatt. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (Tukey-Kramer-Test, n = 6 pro Gruppe). (h) Durchschnittliche Anzahl von Kernen in jedem Zellblatt. Die Anzahl der Kerne innerhalb von 100 μm entlang der Längsachse wurde in Abschnitten jeder Zellschicht gemessen. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (**P < 0,01, Tukey-Kramer-Test, n = 6 pro Gruppe). Wohnen: lebende Laken; Trocken: trockene Laken; FT: gefrorene und aufgetaute Blätter.

Querschnitte jedes Blattes (d. h. lebend, trocken oder FT), gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (HE) und Azan, sind in Abb. 1c, d dargestellt. Alle Blätter waren mehrzellig geschichtet. Die trockene Schicht (21 ± 4,2 µm) war etwas dünner als die lebende Schicht (25,7 ± 5,1 µm) und bestand aus fünf bis sieben Schichten (Abb. 1f, g). Auf dem trockenen Blatt kam es zu leichten morphologischen Veränderungen der Zellkerne, die anschwollen und in ihrer Größe variabler wurden. Die Anzahl der Keime pro 100 μm Blattlänge war auf dem trockenen Blatt deutlich höher, wahrscheinlich aufgrund des geringeren Volumens nach dem Trocknen (Abb. 1h). Die Veränderungen waren auf dem FT-Blatt relativ groß, in dem die Anzahl der Kerne und des Chromatins deutlich reduziert war. Auf allen drei Blättern wurden sowohl blaue Bereiche (was durch Azan-Färbung auf Kollagen hinweist) als auch rote Bereiche (was auf ECM-Kollagen vom Typ I hinweist, wie durch Fluoreszenz-Immunfärbung angezeigt) gefunden; Ihre Bedeutung wurde in der Reihenfolge lebende, trockene und FT-Blätter geordnet (siehe Abb. 1e).

Zellblätter wurden auf einer Bio-Clean-Bank unter den folgenden Bedingungen luftgetrocknet: einer Temperatur von 30,7 °C (im Bereich von 27,6 bis 31,4 °C), einer Luftfeuchtigkeit von 39,6 % (im Bereich von 31,1 bis 49,6 %) und einer Windgeschwindigkeit im Bereich von 0,1 bis 0,4 m/s. Gemessen wurde die Gewichtsveränderung vom lebenden Blatt zum trockenen Blatt während der Lufttrocknung. Das durchschnittliche Gewicht des lebenden Blattes betrug 6,9 mg. Durch Lufttrocknung verringerte sich der Wassergehalt der Zellschicht, und das Gewicht der Zellschicht erreichte nach durchschnittlich 13,7 Minuten (9, 12 und 20 Minuten) aus drei unabhängigen Experimenten das Gleichgewicht. Das durchschnittliche Gewicht einer trockenen Schicht, die das Gleichgewicht erreichte, betrug 0,31 mg (Abb. 2a). Die durchschnittliche Oberfläche des trockenen Blattes betrug 0,31 cm2/Blatt und der Feuchtigkeitsgehalt des trockenen Blattes, gemessen nach der Karl-Fischer-Methode, betrug 3,2 %. Die anfängliche Trocknungsgeschwindigkeit betrug 7,9 mg/min·cm2.

Untersuchung der Gewichtsveränderung und Zytotoxizität von Zellschichten mit der Trocknungszeit. (a) Veränderungen im Gewicht einer mehrschichtigen Fibroblasten-Zellschicht während der Trocknungszeit auf der Bio-Clean-Bank. Das durchschnittliche Gewicht eines lebenden Blattes betrug 6,9 mg. Während des Trocknens betrug das Durchschnittsgewicht nach durchschnittlich 13,7 Minuten 0,31 mg. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die durchgezogenen und die gepunkteten Linien zeigen das Gewicht bzw. die anfängliche Trocknungsgeschwindigkeit. (b) DAPI-Färbung von unfixierten lebenden und trockenen Laken. Als Positivkontrolle wurden in Methanol getauchte lebende Blätter und als Negativkontrolle befestigte Zellblätter verwendet (Maßstab = 50 µm). (c) Bewertung der Beziehung zwischen der Trocknungszeit der Zellblätter und der Schädigung der Zellmembran durch einen LDH-Freisetzungstest unter Verwendung der in Lysepuffer eingetauchten lebenden Schicht als Positivkontrolle und der PBS als Negativkontrolle. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (**P < 0,01, ns: nicht signifikant gegenüber Positivkontrolle, Tukey-Kramer-Test, n = 6 pro Gruppe). (d) Beobachtung der Adhäsionsfähigkeit von Zellschichten nach 24-stündiger Rekultivierung. Die lebenden Blätter (links) hafteten an der Kulturschale und es wurde beobachtet, dass Fibroblasten von den Rändern wanderten, jedoch nicht in trockenen Blättern (rechts; Maßstabsbalken = 50 µm). (e) Bewertung der Zellstoffwechselaktivität einer 24 Stunden lang neu kultivierten Zellschicht mit WST-8-Reagenz. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (**P < 0,01, ns: nicht signifikant, Tukey-Kramer-Test, n = 4 pro Gruppe). Medium: CTS AIM-V + 10 % FBS.

Um den durch Austrocknung verursachten Zelltod zu bewerten, wurden nicht fixierte Zellblätter mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt, um Schäden an der Zellmembran festzustellen. Nur einige der Kerne in den lebenden Schichten waren mit DAPI gefärbt (Abb. 2b). Nach 5, 10 und 15 Minuten Trocknungszeit wurden die Kerne der Zellblätter von der Peripherie der Zellblätter her mit DAPI gefärbt, es gab jedoch ungefärbte Bereiche in der Mitte der Zellblätter (ergänzende Abbildung S2). Fast alle Kerne der 30 Minuten getrockneten Blätter wurden mit DAPI angefärbt (Abb. 2b). Diese Beobachtung legt nahe, dass die Durchlässigkeit der Zellmembran durch den Trocknungsprozess beeinträchtigt wurde. Um geschädigte Zellmembranen quantitativ zu bewerten, wurde ein Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungstest durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen der Trocknungszeit und dem Anteil geschädigter Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zur Positivkontrolle (dem mit Lysepuffer behandelten lebenden Blatt) betrug die LDH-Freisetzungsrate im lebenden Blatt 21 %. Die Freisetzungsrate von LDH nahm mit der Trocknungsdauer zu und betrug 88 % nach 10 Minuten, 92 % nach 15 Minuten und ≥ 98 % nach 30 Minuten, was dem Erreichen eines Gleichgewichtstrockengewichts entspricht (Abb. 2c).

Um das Überleben der Zellen zu bestätigen, wurden die Zellblätter 24 Stunden lang erneut kultiviert. Die lebende Schicht haftete an der Unterseite der Kulturschale und Fibroblasten wanderten vom Rand der Schicht ab, während es bei der trockenen Schicht weder zu einer Adhäsion an der Kulturschale noch zu einer Migration von Fibroblasten kam (Abb. 2d). Trockene Zellblätter, die 24 Stunden lang kultiviert wurden, zeigten keine Stoffwechselaktivität und die Absorption war mit der des Kulturmediums vergleichbar (Abb. 2e). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zellmembranen auf der trockenen Folie durch das Trocknen erheblich geschwächt wurden und dass das Trocknen der Folie die Lebensaktivität irreversibel einstellte, was auf Zelltod schließen lässt.

Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurde die Trocknungszeit auf 30 Minuten festgelegt, um zuverlässige Trocknungsbedingungen zu gewährleisten. Daher wurden die folgenden Experimente mit einem trockenen Blatt durchgeführt, das 30 Minuten lang luftgetrocknet und bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur (23 °C) gelagert wurde.

Um die in trockenen Zellschichten verbleibenden Wachstumsfaktoren und Zytokine mithilfe der Überstände lysierter Zellschichten zu bestimmen, haben wir die Konzentrationen von VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1 mithilfe von ELISA gemessen. In trockenen Blättern entsprach die Menge jedes Wachstumsfaktors der in lebenden Blättern, wohingegen FT-Blätter deutlich niedrigere Werte aufwiesen (Abb. 3a). Anschließend untersuchten wir, ob diese Wachstumsfaktoren aus trockenen Blättern in das Medium abgegeben wurden. Jedes Zellblatt wurde in 200 µl Medium eingetaucht und 24 Stunden lang inkubiert, gefolgt von der Sammlung der Überstände vom eingetauchten Zellblatt. VEGF und HGF wurden sowohl im lebenden Blatt- als auch im trockenen Blatt-Eluat nachgewiesen, wohingegen FGF-2 und HMGB1 nur im trockenen Blatt-Eluat nachgewiesen wurden (Abb. 3b). Wir untersuchten die Lokalisierung von FGF-2 und HMGB1 in jeder Zellschicht weiter durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung. FGF-2 war hauptsächlich im Zytoplasma lebender und trockener Schichten lokalisiert, wurde jedoch in den FT-Schichten nicht nachgewiesen (Abb. 3c). Es wurde festgestellt, dass HMGB1 in lebenden und trockenen Schichten hauptsächlich im Zellkern kolokalisiert ist, in FT-Schichten jedoch nicht nachgewiesen wurde (Abb. 3d). Darüber hinaus waren die Immunfärbungssignale für FGF-2 und HMGB1 in den trockenen Blättern nach dem Eintauchen deutlich verringert (ergänzende Abbildung S3). Diese Beobachtungen zeigen, dass intrazelluläres FGF-2 und HMGB1 in trockenen Schichten leicht aus den Zellen freigesetzt wurden, da die Zellmembran und die Kernhülle durch Lufttrocknung geschwächt wurden.

Wachstumsfaktoren und Zytokine werden in trockenen Schichten aus Zellen freigesetzt. (a) Der Retentionsgrad der Wachstumsfaktoren aus jeder Zellschicht. Die Konzentration von VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1 im Überstand jedes Zellblattlysats, gemessen durch ELISA. Das Lysat wurde durch Eintauchen der Zellschicht in 200 µL Zelllysepuffer 2 hergestellt. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (**P < 0,01, ns: nicht signifikant, Tukey-Kramer-Test, n = 3 pro Gruppe). (b) Geben Sie Mengen an Wachstumsfaktoren aus jeder Zellschicht frei. Konzentrationen von VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1 im Überstand von Eluatproben, gemessen durch ELISA. Die Eluatproben wurden hergestellt, indem jedes Zellblatt 24 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen in 200 µL CTS AIM-V mit 10 % FBS getaucht wurde. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (**P < 0,01, Tukey-Kramer-Test, n = 4 pro Gruppe). Signifikante Unterschiede wurden nur zwischen lebenden, trockenen und FT-Blättern untersucht. Kultursupplement: Kulturüberstand zum Zeitpunkt der Blattvorbereitung (CTS AIM-V + HFDM-1(+) + 5 % FBS), Medium: CTS AIM-V + 10 % FBS. (c) Querschnitte der lebenden, trockenen und FT-Blätter mit Immunfluoreszenzfärbung von FGF-2 (rot) und DAPI (blau); (Maßstabsbalken = 50 µm). (d) Querschnitte der lebenden, trockenen und FT-Blätter mit Immunfluoreszenzfärbung von HMGB1 (rot) und DAPI (blau; Maßstabsbalken = 50 µm). Wohnen: lebende Laken; Trocken: trockene Laken; FT: gefrorene und aufgetaute Blätter.

Um die Bioaktivität des Trockenblatteluats zu untersuchen, untersuchten wir die Zellproliferation sowie die VEGF- und HGF-Produktion in Fibroblasten in vitro. Fibroblasten wurden 48 Stunden lang mit Medium und Eluat im Verhältnis 1:1 kultiviert. Das trockene Blatteluat war 1,75-mal höher als die Kontrolle und zeigte eine signifikant höhere Zellproliferation als das lebende oder FT-Blatt-Eluat (Abb. 4a). Als nächstes wurden die Konzentrationen von VEGF und HGF in Kulturüberständen gemessen (Abb. 4b, c). Im Trockeneluat mit Fibroblasten wurden im Vergleich zur Kontrolle signifikante Mengen an VEGF und HGF nachgewiesen, wohingegen im Trockeneluat ohne Fibroblasten keine hohen Mengen an VEGF und HGF nachgewiesen wurden, wie in Abb. 3b dargestellt. Dies könnte auf die Stabilität der Wachstumsfaktoren während der 48-stündigen Inkubation zurückzuführen sein. Daher wurden die Unterschiede zwischen den Werten für Eluat mit und ohne Fibroblasten als VEGF- und HGF-Gehalt betrachtet, der aufgrund der Stimulation des Eluats neu aus Fibroblasten produziert und im Verhältnis zur Kontrolle verglichen wurde (Abb. 4d, e). Das trockene Blatteluat induzierte deutlich höhere VEGF- und HGF-Produktionsraten, die 1,53- und 4,64-mal höher waren als in der Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass das trockene Blatteluat biologische Wirkungen auf Zellen hatte.

Erhöhte Zellproliferation, VEGF- und HGF-Produktion in Fibroblasten durch das Eluat trockener Blätter. Eluatproben wurden hergestellt, indem jedes Zellblatt 24 Stunden lang in 200 μl DMEM getaucht wurde, und der Überstand wurde nach der Zentrifugation gesammelt. (a) Fibroblasten wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 8000 Zellen pro Vertiefung in 100 μl DMEM mit 10 % FBS ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 100 μl der Eluatproben oder DMEM als Kontrolle. Zusätzlich wurden 100 μl der Eluatprobe zu 100 μl DMEM mit 10 % FBS pro Vertiefung hinzugefügt, um eine Eluatprobe ohne Fibroblasten zu erhalten. Nach 48-stündiger Inkubation unter normoxischen Bedingungen wurde der Kulturüberstand gesammelt und der Zellproliferationstest mit dem WST-8-Reagenz durchgeführt. Die Zellproliferationsrate wurde unter Verwendung von in DMEM kultivierten Fibroblasten als Kontrolle berechnet. (b,c) Konzentrationen von VEGF und HGF im Kulturüberstand von durch Eluat stimulierten Fibroblasten. (d,e) VEGF- und HGF-Produktionsverhältnisse aus Fibroblasten bei Eluatstimulation. Die Verhältnisse wurden unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: [(Überstand der mit der Eluatprobe kultivierten Fibroblasten) – (Überstand der Eluatprobe ohne Fibroblasten)]/(Überstand der mit DMEM kultivierten Fibroblasten). Als Kontrolle dienten in DMEM kultivierte Fibroblasten. (f) Die Eluatproben wurden 60 Minuten lang bei 37 °C mit Anti-FGF-2 oder Kontrollantikörper inkubiert. Fibroblasten wurden in 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 8000 Zellen pro Well in 100 μl DMEM mit 1 % FBS ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 100 μl entweder der Eluatprobe mit den Antikörpern oder DMEM mit rFGF-2 (0 oder 1 %). 5 ng/ml) mit Antikörpern. Nach einer 48-stündigen Inkubation unter normoxischen Bedingungen wurde der Kulturüberstand abgesaugt und der Zellproliferationstest mit dem WST-8-Reagenz durchgeführt. Die Zellproliferationsrate wurde unter Verwendung von in 0 ng/ml rFGF-2 kultivierten Fibroblasten mit dem Kontrollantikörper als Kontrolle berechnet. Die Daten in allen Panels werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (*P < 0,05, **P < 0,01, Tukey-Kramer-Test, n = 9 pro Gruppe). Lebend: Eluat lebender Blätter, Trocken: Eluat trockener Blätter, FT: Eluat gefrorener und aufgetauter Blätter, rFGF-2: rekombinantes FGF-2-Protein.

FGF-2 ist ein starker Wachstumsfaktor. Das trockene Blatteluat enthielt eine große Menge an FGF-2, was darauf hindeutet, dass FGF-2 die biologische Aktivität beeinflussen könnte. Daher untersuchten wir mithilfe eines neutralisierenden Antikörpers gegen FGF-2 oder rekombinantes FGF-2-Protein (rFGF-2), ob FGF-2 im Eluat die Fibroblastenproliferation direkt beeinflusst. In Gegenwart eines Kontrollantikörpers (Maus-IgG1-Isotyp-Kontrolle) wurde die proliferative Reaktion von Fibroblasten durch Trockenschichteluat oder rFGF-2 gefördert. Diese proliferativen Reaktionen wurden jedoch durch die FGF-2-Neutralisierung signifikant gehemmt (Abb. 4f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die biologische Aktivität der trockenen Blätter hauptsächlich auf die Wirkung von FGF-2 zurückzuführen ist.

Autologe (C57BL/6N-Maus) und allogene (C3H/He-Maus) Zellblätter wurden in 6 mm dicke dorsale Hautdefekte diabetischer Mäuse (männlich, C57BL/6N) transplantiert, und jede Wunde wurde an den Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 (n = 6; Abb. 5a,b). Die Wundverschlussrate war in den Behandlungsgruppen mit autologen und allogenen Trockentüchern am 5. Tag signifikant höher als in der Kontrollgruppe ohne Behandlung (Gruppe mit autologen Trockentüchern und allogenen Trockentüchern vs. Kontrollgruppe ohne Behandlung: 74,2 ± 5,0 % [ P < 0,05] und 80,0 ± 4,9 % [P < 0,01] vs. 51,0 ± 7,2 % am Tag 7 (autologes Trockenblatt und allogenes Trockenblatt vs. keine Behandlung: 95,8 ± 2,1 % [P < 0,01] und 90,0 % ± 4,0 % [P < 0,05] vs. 72,4 ± 5,7 % und am Tag 9 (autologes Trockenblatt vs. keine Behandlung: 99,4 ± 0,5 % [P < 0,01] vs. 91,0 ± 2,4 %; Abb. 5c ,D).

Therapeutische Wirkung trockenkonservierter mehrschichtiger Fibroblastenzellblätter. (a) Repräsentative makroskopische Bilder der Wunde an den Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 bei der autologen Zellblatttransplantationstherapie. Lebende Blätter, trockene Blätter und FT-Blätter-Gruppen, die von autologen Fibroblasten (C57BL/6N-Maus) hergestellt wurden, wurden auf Hautdefekte in 6-mm-Modellen für den kutanen Wundverschluss auf dem Rücken von diabetischen männlichen C57BL/6N-Mäusen übertragen. Die Kontrolle zeigt keine Behandlung an. (b) Repräsentative makroskopische Bilder der Wunde an den Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 bei der allogenen Zellblatttransplantationstherapie. Lebende Blätter, trockene Blätter und FT-Blätter-Gruppen, die von allogenen Fibroblasten (C3H/He-Maus) hergestellt wurden, wurden auf Hautdefekte in 6-mm-Modellen für den kutanen Wundverschluss in voller Dicke des Rückens diabetischer männlicher C57BL/6N-Mäuse übertragen. Die Kontrolle zeigt keine Behandlung an. (c) Die Wundverschlussrate der autologen Zellblatttransplantationstherapie durch lebende Blätter (n = 6), trockene Blätter (n = 6), FT-Blätter (n = 6) und Kontrollgruppe (keine Behandlung) (n = 6). ). Die Wundverschlussrate wurde als Prozentsatz der anfänglichen Wundfläche zu den angegebenen Zeitpunkten berechnet. Fehlerbalken geben den Standardfehler an. Die Werte werden als Mittelwert ± SE ausgedrückt (*P < 0,05, **P < 0,01, Tukey-Kramer-Test). (d) Die Wundverschlussrate der allogenen Zellblatttransplantationstherapie durch lebende Blätter (n = 6), trockene Blätter (n = 6), FT-Blätter (n = 6) und Kontrollgruppe (keine Behandlung) (n = 6). ). Die Wundverschlussrate wurde als Prozentsatz der anfänglichen Wundfläche zu den angegebenen Zeitpunkten berechnet. Fehlerbalken geben den Standardfehler an. Die Werte werden als Mittelwert ± SE ausgedrückt (*P < 0,05, **P < 0,01, Tukey-Kramer-Test).

Die Beobachtung von Gewebeproben, die 30 Tage nach der Transplantation jeder Zellschicht entnommen wurden, zeigte nach der Wundheilung in allen Zellschicht-Transplantationsgruppen, sowohl unter Verwendung autologer als auch allogener Zellen, im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung keine abnormalen Befunde im Gewebe (ergänzende Abbildung S4). .

Wir untersuchten die Position allogener Trockenschichten während der Wundheilung. Die trockenen Blätter unterschieden sich von den blauen Bereichen an der Applikationsstelle (Abb. 6b, d), da die Kollagenfasern der Blätter durch Azan-Färbung blau gefärbt waren (Abb. 1d). Einen Tag nach der Transplantation bedeckte ein trockenes Tuch die gesamte Wunde (Abb. 6a, c). Die trockenen Schichten waren mit Leukozyten infiltriert, bei denen es sich offenbar um Neutrophile oder Makrophagen handelte. Es gab einen deutlichen Unterschied in der Kernfarbe zwischen den infiltrierten Leukozyten und der Schicht. Die Kerne der infiltrierten Leukozyten waren bei der HE-Färbung deutlich sichtbar, wohingegen die Kerne der aus trockenen Schichten gewonnenen Zellen mit der Zeit nach der Transplantation schwach und undeutlich färbten (ergänzende Abbildung S5). 3, 5 und 7 Tage nach der Transplantation trockener Blätter zeigte die Azan-Färbung „gefaltete“ blattartige Strukturen und einen Zusammenbruch im Vergleich zu einem Tag nach der Transplantation. Das trockene Blatt befand sich direkt unter dem gebildeten Schorf oder der Epidermis und konnte anhand des Querschnitts am 9. Tag nicht bestätigt werden. Im Gegensatz dazu wurden in der Kontrollgruppe ohne Behandlung keine blattartigen Strukturen beobachtet (Abb. 6e, f). ).

Histologische Analyse des Behandlungsverlaufs nach Trockenblatttransplantation. (a) HE-gefärbter Querschnitt einer Hautwunde einer Maus, die an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 mit der trockenen Folie transplantiert wurde (Maßstabsbalken = 500 µm). Die schwarzen Pfeile zeigen den Rand des Neoepithels. (b) Azan-gefärbter Querschnitt einer mit der Trockenfolie transplantierten Maus-Hautwunde an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 (Maßstabsbalken = 500 µm). Die schwarzen Pfeile zeigen den Rand des Neoepithels. (c) Das im Quadrat in (a) eingeschlossene Bild an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 (Maßstabsbalken = 50 µm). Die weißen Pfeile zeigen das trockene Blatt. (d) Das im Quadrat in (b) eingeschlossene Bild an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 (Maßstabsbalken = 50 µm). Die weißen Pfeile zeigen das trockene Blatt. HE: Hämatoxylin-Eosin. (e) HE-gefärbter Querschnitt einer Hautwunde bei Mäusen in der Gruppe ohne Behandlung an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 (Maßstabsbalken = 500 µm). Die schwarzen Pfeile zeigen den Rand des Neoepithels. (f) Azan-gefärbter Querschnitt einer Hautwunde bei Mäusen in der Gruppe ohne Behandlung an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 (Maßstabsbalken = 500 µm). Die schwarzen Pfeile zeigen den Rand des Neoepithels.

Interessanterweise zeigten histologische Beobachtungen, dass die Behandlung mit trockenen Laken die Wundheilung förderte. Am Tag 3 nach der Transplantation zeigte die Gruppe mit allogener Trockenblattbehandlung einen signifikanten Anstieg der Anzahl von Keratinozytenschichten und Mikrogefäßen am Wundrand im Vergleich zu der Gruppe ohne Behandlung (ergänzende Abbildung S6a – d). In Übereinstimmung mit makroskopischen Beobachtungen der Wundheilung (Abb. 5b, d) zeigte die Länge des Neoepithels an den Tagen 5 und 7 nach der Transplantation eine signifikante Verlängerung in der allogenen Trockenblatt-Behandlungsgruppe im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe ohne Behandlung (Ergänzende Abbildung S6e – h).

Um die Lagerstabilität der in den Trockenplatten enthaltenen Wachstumsfaktoren zu untersuchen, haben wir die Lagertemperaturen und Lagerdauern an gleichzeitig hergestellten Trockenplatten untersucht. Trockene Blätter wurden 1 Tag und 1, 2 oder 4 Wochen lang bei Kühltemperatur (4 °C) und Raumtemperatur (23 °C) gelagert. Anschließend wurden die Eluate vorbereitet, indem jedes trockene Blatt 24 Stunden lang in das Medium getaucht und bis zur Messung bei –30 ° C gelagert wurde. Die Konzentrationen von VEGF und HGF zeigten keine größeren Schwankungen mit der Temperatur oder der Lagerdauer, aber die Konzentrationen von FGF-2 und HMGB1 nahmen bei Raumtemperatur während der vierwöchigen Lagerdauer allmählich ab (Abb. 7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die gekühlte Lagerung für trockene Platten geeignet ist und diese mindestens 4 Wochen lang stabil bleiben.

Untersuchung der Lagerstabilität trockener Platten. Gleichzeitig hergestellte Trockenblätter wurden entweder 1 Tag, 1, 2 oder 4 Wochen lang bei Kühltemperatur (4 °C) und Raumtemperatur (23 °C) gelagert, und dann wurden die Eluate durch Eintauchen jedes Trockenblatts in 200 µL CTS hergestellt AIM-V mit 10 % FBS für 24 h unter normoxischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) und bis zur Messung bei −30 °C gelagert. Die Konzentrationen von VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1 im Überstand der Eluatproben wurden mittels ELISA gemessen. 1D: Lagerdauer 1 Tag. 1 W: Lagerdauer 1 Woche. 2 W: Lagerdauer 2 Wochen. 4 W: Lagerdauer 4 Wochen. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt (*P < 0,05 gegenüber 1D 4 ℃, **P < 0,01 gegenüber 1D 4 ℃, †P < 0,05 gegenüber 1D 23 ℃, ††P < 0,01 gegenüber 1D 23 ℃, Dunnett-Test, n = 4 pro Gruppe).

In der Zellblatttransplantationstherapie wird die Theorie aufgestellt, dass die wichtigsten Effektoren lebende Zellen sind und dass therapeutische Wirkungen aufgrund der von ihnen produzierten Faktoren erzielt werden können. In Übereinstimmung mit dieser Theorie haben frühere Studien gezeigt, dass Zellschichten verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine produzieren, darunter VEGF, HGF, transformierender Wachstumsfaktor Beta1 und chemotaktisches Monozytenprotein 1, die die Wundheilung fördern7,9. Daher ist es allgemein anerkannt, dass nicht lebensfähige trockene Blätter keine kontinuierlichen Wachstumsfaktoren absondern und die Wundheilung nur in begrenztem Maße fördern können. Überraschenderweise zeigten unsere Daten, dass trockene Tücher mit autologen oder allogenen Zellen nicht wesentlich weniger wirksam waren als lebende Tücher und eine deutliche Förderung der Wundheilung im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Behandlung ausübten (Abb. 5). Aufgrund der Unterschiede zwischen trockenen und FT-Blättern wurde dies wahrscheinlich durch die bioaktiven Substanzen verursacht, die aus den trockenen Laken freigesetzt wurden.

Wir fanden heraus, dass ähnliche Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen, einschließlich VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1, in Zellen trockener Blätter wie in denen lebender Blätter erhalten blieben und dass diese Substanzen leicht aus den Zellen in die Lösung freigesetzt wurden ( Abb. 3a,b). Bemerkenswerterweise wurden FGF-2 im Zytoplasma und HMGB1 im Zellkern nicht von den lebenden Schichten abgesondert, sondern von den trockenen Schichten freigesetzt (Abb. 3b). Wir haben durch In-vitro-Untersuchung eines Fibroblasten-Proliferationstests bestätigt, dass das trockene Blatteluat eine stärkere Bioaktivität aufwies als das lebende Blatteluat (Abb. 4a). Darüber hinaus stimulierte das Eluat Fibroblasten und steigerte die VEGF- und HGF-Produktion (Abb. 4b–d), was darauf hindeutet, dass aus den trockenen Schichten freigesetzte Substanzen sowohl direkt als auch indirekt die Wundheilung und Angiogenese fördern.

Hohe Mengen an FGF-2 wurden von den trockenen Blättern in das Medium freigesetzt und waren an der biologischen Aktivität beteiligt. FGF-2 ist ein starker Wachstumsfaktor und wichtig für die Förderung der Wundheilung und Angiogenese16. Obwohl FGF-2 in Fibroblasten stark exprimiert wird, ist seine extrazelluläre Sekretion aufgrund des Mangels an sekretorischen Signalpeptiden im Allgemeinen ineffizient. Daher erfolgt die Freisetzung von FGF-2 hauptsächlich aus beschädigten oder toten Zellen17,18,19,20. Eine frühere Studie zur Transplantationstherapie mit mesenchymalen Stromazellen (MSC) zeigte, dass hohe Mengen an FGF-2, die aus verletzten transplantierten MSCs freigesetzt wurden, die Angiogenese und Neuropoese stimulierten20. Anschließend gab es keine Berichte über FGF-2 als Effektor, der von Zellschichten abgesondert wird. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass das trockene Blatteluat die proliferative Aktivität von Fibroblasten fördert, die durch den neutralisierenden FGF-2-Antikörper deutlich unterdrückt wurde (Abb. 4f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Freisetzung von FGF-2 aus trockenen Laken eine wichtige Rolle bei der Förderung der Wundheilung und Angiogenese spielt.

Das In-vivo-Experiment unter Verwendung eines Hautwundenmodells einer diabetischen Maus zeigte, dass es am 13. Tag keinen Unterschied im Wundverschluss zwischen der Trockentuchgruppe und der Kontrollgruppe gab. Allerdings gab es einen signifikanten Unterschied in der Geschwindigkeit des Wundverschlusses durch makroskopische Beobachtung am 5. Tag , 7 und 9 Tage nach der Behandlung (Abb. 5). An den Tagen 5 und 7 nach der Behandlung nahm histologisch die Epithelisierung in der Trockenblattgruppe signifikant zu (ergänzende Abbildung S6e – h), und am Tag 3 nach der Behandlung gab es einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Mikrogefäße und dem Keratinozytenwachstum am Wundrand (Ergänzende Abbildung S6a – d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Wachstumsfaktoren in der frühen Phase nach der Transplantation aus den trockenen Schichten freigesetzt wurden und dass sie sowohl direkt als auch indirekt sowohl Fibroblasten als auch Zellen in der Wundumgebung, einschließlich Keratinozyten und Gefäßendothelzellen, stimulierten, was möglicherweise die Wundheilung gefördert hat. Wir beobachteten, dass die blattartige Struktur, die ECM enthielt, die Wunde vor äußeren Faktoren zu schützen schien (Abb. 6), eine Zellproliferation innerhalb der Blattstruktur konnten wir jedoch nicht bestätigen. Die Eigenschaften und möglichen Wirkmechanismen der in dieser Studie verwendeten Zellblätter sind in Abb. 8 zusammengefasst.

Schema des Mechanismus für die Wundheilungswirkung jeder Zellschicht. Es wurde angenommen, dass lebende Tücher die größte therapeutische Wirkung haben, wenn sie nach dem Aufbringen auf die Wunde verpflanzt werden. Während die lebenden Blätter lebten, förderte der parakrine Effekt der kontinuierlichen Sekretion großer Mengen an Wachstumsfaktoren die Wundheilung. Wenn trockene Tücher in Wunden transplantiert werden, setzen sie vorübergehend verschiedene Wachstumsfaktoren frei, von denen angenommen wird, dass sie die Angiogenese und die Aktivierung von Zellen um die Wunde stimulieren. Darüber hinaus behielten alle Zellschichten ECM, was die Wundheilung durch den Schutz der Wunde gefördert haben könnte. Aufgrund dieser Unterschiede im Wirkmechanismus ergab sich folgende Rangfolge für die Beschleunigung der Wundheilung: lebende Blätter > trockene Blätter > FT-Blätter. ECM: extrazelluläre Matrix.

Wenn das trockene Blatteluat mit einer überschüssigen Menge des neutralisierenden FGF-2-Antikörpers behandelt wurde, wurde die Zellproliferation auf das gleiche Niveau wie bei der Kontrolle gehemmt. Allerdings war die Zellproliferationsreaktion auf das Trockenschichteluat deutlich höher als die auf rFGF-2 allein (Abb. 4f). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass auch andere Substanzen als FGF-2 die Zellproliferation beeinflussen können. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, werden Kernsubstanzen wie HMGB1, die zusammenfassend als Alarmine bekannt sind und als Abwehrfaktoren wirken21,22 und an der Förderung der Wundheilung23,24,25,26 beteiligt sind, auch aus den trockenen Laken freigesetzt, was darauf hindeutet Mehrere Faktoren können zusammenwirken, um die Wundheilung zu fördern.

In unserer vorherigen Studie verschwanden lebende Blätter, die sowohl autologe als auch allogene Maus-Hautgeschwürmodelle transplantiert hatten, am 9. Tag der In-vivo-Bildgebung von Luciferase-exprimierenden Fibroblasten9. In ähnlicher Weise zeigten histologische Beobachtungen des Wundheilungsprozesses, dass sich die allogenen Trockenschichten während der Epithelisierung unter der Epidermisschicht befanden, nach Abschluss der Epithelisierung am Tag 9 jedoch keine Trockenschichten in den Gewebeproben verblieben waren (Abb. 6). Es wurde vermutet, dass sich die trockene Schicht auf natürliche Weise zersetzte und von den infiltrierenden Leukozyten absorbiert wurde. Eine frühere Studie mit von Menschen stammenden epidermalen Zellschichten in einem Mausgeschwürmodell unter der Annahme einer allogenen Transplantation beim Menschen bestätigte, dass die Schichten während des Wundheilungsprozesses ex vivo ausgeschieden wurden27. Diese Beobachtungen legen nahe, dass aus Fibroblasten gewonnene Trockenschichten nicht nur auf der Körperoberfläche, sondern auch auf inneren Organen verwendet werden können, da sie zersetzt und absorbiert werden. Zuvor haben wir auch die Wirksamkeit einer mehrschichtigen Fibroblastenzellschicht für postoperative Bronchial- und Pankreasfisteln in Tiermodellen nachgewiesen28,29. Darüber hinaus können Trockentücher auch als biologische Beschichtungsmaterialien verwendet werden, um die Gewebereparatur zu fördern und verschiedene postoperative Komplikationen zu verhindern.

Hier bestätigen wir, dass die in der gekühlten Trockenfolie zurückgehaltenen bioaktiven Substanzen mindestens einen Monat lang stabil waren und dass einige bioaktive Substanzen auch bei Lagerung bei Raumtemperatur erhalten blieben (Abb. 7). Obwohl in den Mausexperimenten dieser Studie trockene Laken verwendet wurden, die sieben Tage oder weniger bei Raumtemperatur gelagert wurden, zeigte die Behandlungsgruppe mit trockenen Laken im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung signifikante wundheilungsfördernde Wirkungen. Da die In-vitro-Lagerstabilitätsstudie ergab, dass die Menge an FGF-2 von der Lagertemperatur beeinflusst wird, kann durch eine strenge Kontrolle der Lagertemperatur eine bessere therapeutische Wirkung erwartet werden.

Trockene Blätter behalten ihre blattartige Struktur und behalten gleichzeitig ein gewisses Maß an Steifigkeit bei, was bedeutet, dass sie ohne die für die Zellblatttransplantationstherapie erforderliche Unterstützung verwendet werden können und den Vorteil einer einfacheren Handhabung haben (ergänzende Abbildung S1). Mehrere dehydrierte Fruchtwassermembranblätter wurden bereits zur Behandlung von Hautgeschwüren verwendet30. Aus Fibroblasten gewonnene Trockenblätter haben Vorteile hinsichtlich der Stabilität der Materialverfügbarkeit und der Sicherheit vor Infektionen durch Spender. Unsere Trockenplatten können aus einem einzigen Material in Massenproduktion hergestellt werden, was eine stabile Versorgung und eine gleichmäßige Produktqualität gewährleistet.

Als Einschränkung gilt, dass gemäß unseren früheren Studien5,6,7 alle in dieser Studie verwendeten Zellblätter aus hypoxischen, vorkonditionierten, mehrschichtigen Fibroblasten-Zellblättern hergestellt wurden, da die Behandlung der hypoxischen Vorkonditionierung die sekretorische Potenz des Fibroblasten wirksam erhöht. Vor dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass trockene Laken durch dieselben Wachstumsfaktoren, die von lebenden Laken abgesondert werden, eine wundheilende Wirkung haben könnten. Im Gegensatz zum Wirkmechanismus herkömmlicher Zellschichten wurde jedoch deutlich, dass die Freisetzung von FGF-2 aus trockenen Zellschichten, das von lebenden Zellschichten nicht abgesondert wird, eine wichtige Rolle bei der Wundheilung spielt. Daher muss in Zukunft die Auswirkung der hypoxischen Vorkonditionierung auf die im Trockenblatt zurückgehaltenen Wachstumsfaktoren untersucht werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies die erste Studie ist, die zeigt, dass die Wundheilungsfähigkeit allogener Trockentücher bei Hautgeschwüren mit autologen Trockentüchern vergleichbar ist. Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass die trockenen Laken bioaktive Substanzen, einschließlich FGF-2, aus den Zellen zurückhielten und freisetzten, um die Wundheilung zu fördern. Trockene Platten können problemlos gekühlt oder bei Raumtemperatur gelagert werden und können schnell und stabil geliefert werden. Daher stellen allogene Trockenschichten ein nützliches Instrument zur Behandlung von Hautgeschwüren dar.

Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Yamaguchi-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer 31-093).

Männliche C57BL/6N- und C3H/He-Mäuse (6 Wochen alt) wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) gekauft. Sie wurden in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C), Luftfeuchtigkeit (70 ± 20 %) und Licht (12-Stunden-Hell-/Dunkel-Zyklen) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.

Fibroblasten wurden mithilfe von Kollagenase (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) aus der Schwanzhaut von Mäusen isoliert und in CTS™ AIM-V™-Medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit 10 % fötalem Rinderserum kultiviert ( FBS; Thermo Fisher Scientific). Primäre Fibroblastenzellen wurden in einer normalen 24-Well-Platte (4,2 × 105 Zellen/Well) unter Verwendung von 2 ml Medium bestehend aus CTS™ AIM-V™ und HFDM-1 (+) (Cell Science & Technology Institute, Sendai, Japan) ausgesät. ergänzt mit 5 % FBS und wurden unter normoxischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) für 2 Tage inkubiert, gefolgt von hypoxischen Bedingungen (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) für 1 Tag Behandlung der hypoxischen Vorkonditionierung5,6,7. Nach der Inkubation wurden mehrschichtige Fibroblasten-Zellschichten zweimal mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann mit 500 µL Dispase-Lösung (10 PU/ml, FUJIFILM Wako) 30 Minuten lang unter normoxischen Bedingungen inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die mehrschichtigen Fibroblastenzellblätter vorsichtig von den Kulturplatten abgelöst. Diese Laken wurden in dieser Studie als lebende Laken verwendet.

Die Lufttrocknung wurde in einer Bio-Reinbank (CCV-1300E, Hitachi, Ltd., Tokio, Japan) durchgeführt, wobei die Pilotflamme des Gasbrenners in der Mitte betrieben wurde, wo ein sauberer Betrieb aufrechterhalten werden konnte. Lebende Blätter wurden mit einer 1000-µL-Spitze mit breiter Bohrung auf einen Silikonsockel übertragen und entfaltet, um Faltenbildung zu vermeiden. Nachdem so viel Wasser wie möglich entfernt wurde, ließ man die Platten 30 Minuten lang stehen. Die getrockneten Zellschichten wurden mit einer Pinzette vom Silizium abgezogen und in 1,5-ml-Mikroröhrchen überführt. Für Transplantationsexperimente wurden trockene Blätter bei Raumtemperatur (23 °C) gelagert und innerhalb einer Woche nach der Vorbereitung verwendet. Für Lagerstabilitätsexperimente wurden trockene Blätter mit einem Trockenmittel bei Kühltemperatur (4 °C) oder Raumtemperatur (23 °C) gelagert.

Eine Kulturplatte mit 24 Vertiefungen, die lebende Blätter enthielt, wurde in einen verschließbaren Plastikbeutel überführt und für 60 Minuten in einen Tiefkühlschrank (–80 °C) gestellt, gefolgt vom Auftauen in einem Inkubator (37 °C) für 90 Minuten. Die Einfrier- und Auftauzyklen wurden dreimal wiederholt, um die Zellmembranen zu zerstören, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 2 ml PBS, um FT-Blätter zu erhalten. FT-Blätter wurden nach dem dritten Gefrierzyklus (–80 °C) bis zur Verwendung gelagert.

Acht lebende Blätter wurden mit einer 1000-µL-Spitze mit breiter Bohrung auf eine Kunststoffplatte übertragen, und die Gewichtsveränderung wurde jede Minute mit einer Waage XS104 (Mettler Toledo, Inc.) gemessen, die auf einer Bio-Clean-Bank installiert war. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und die Trocknungsgeschwindigkeit berechnet. Die Umgebungsbedingungen in der Bio-Clean-Bank wurden mit HYGROPALM-HP32 (Rotronic, Bassersdorf, Schweiz) und INFURIDER Handy Anemometer (AP-816B, AOPUTTRIVER) gemessen.

Das Gesamtgewicht der 50 trockenen Blätter wurde gemessen und die Blätter wurden zwei Stunden lang in 2 ml Methanol eingetaucht. Die Wassermenge im Methanol wurde mit der Karl-Fischer-Methode (Japan Testing Laboratories, Inc., Ohgaki, Japan) gemessen. Die Karl-Fischer-Methode wurde zweimal durchgeführt.

Nicht fixierte Zellblätter wurden mit DAPI (Dojindo, Kumamoto, Japan) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem BZ-X710-Mikroskop (Keyence, Osaka, Japan) aufgenommen.

Einzelne lebende Blätter wurden 5, 10, 15, 30, 45 oder 60 Minuten lang luftgetrocknet und sofort 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 500 µL PBS eingetaucht. Die LDH im Überstand jedes Zellblatts wurde mit einem LDH-Zytotoxizitätserkennungskit (Dojindo) gemessen, wobei das lebende Zellblatt als Positivkontrolle in 500 µL Zelllysepuffer und PBS als Negativkontrolle eingetaucht war.

Die nach 30-minütigem Trocknen erhaltenen lebenden Blätter und trockenen Blätter wurden auf eine andere 12-Well-Platte mit 2 ml CTS™ AIM-V™ mit 10 % FBS übertragen und 24 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen kultiviert. Die Zellschichten wurden unter Verwendung eines optischen Phasendifferenzmikroskops beobachtet. Die zelluläre Stoffwechselaktivität der rekultivierten Zellblätter wurde wie folgt analysiert: Nach dem Entfernen der Kulturüberstände wurde 1 ml CTS™ AIM-V™ mit 10 % FBS mit 10 % [2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)- 3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, Mononatriumsalz] (WST-8) Reagenz (Cell Count Reagent SF; Nacalai Tesque, Inc. Kyoto, Japan) wurde zu jedem hinzugefügt gut gewaschen und 3 Stunden unter normoxischen Bedingungen inkubiert. Die Absorption des Überstands wurde bei 450 nm gemessen (Referenzwellenlänge: 630 nm).

Das detaillierte Protokoll wurde zuvor beschrieben7. Kurz gesagt, Zellblätter wurden auf einen CellShifter (CellSeed Inc., Tokio, Japan) übertragen, um Gewebeschnitte vorzubereiten. Isolierte Hautgewebe oder Zellschichten wurden in einer 10 %igen Formalin-Neutralpufferlösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Drei Mikrometer dicke Schnitte wurden auf Objektträger montiert und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) oder Azan gefärbt. Die Immunfärbung wurde unter Verwendung primärer Kaninchenantikörper für Anti-Kollagen I (1:200, ab34710, Abcam, Cambridge, UK), Anti-FGF-2 (1:30, ab208687, Abcam) und Anti-HMGB-1 (1: 400, ab79823, Abcam), Kaninchen-Anti-CD31-Antikörper (1:200, ab28364, Abcam) und ein sekundärer Antikörper für DyLight550-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H&L) (1:200, ab96884; Abcam). Zur Färbung der Zellkerne wurde DAPI verwendet. Alle histologischen Bilder wurden mit dem BZ-X710-Mikroskop aufgenommen und mit dem BZ-X-Analysegerät (Keyence) analysiert. Alle histologischen Analysen wurden von einem Pathologen durchgeführt.

Zellblätter wurden in 1,5-ml-Mikroröhrchen mit verschlossenem Deckel eingetaucht. Um die Zytokinspiegel innerhalb der Zellblätter zu messen, wurde jedes Zellblatt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 200 μl Zelllysepuffer 2 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA) eingetaucht. Um die aus den Zellschichten freigesetzten Zytokinspiegel zu messen, wurde jede Zellschicht 24 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen (37 °C) in 200 µL CTS™ AIM-V™ mit 10 % FBS getaucht. Nach der Inkubation wurden die Proben 5 Minuten lang bei 4 °C und 2460 × g zentrifugiert, die Überstände gesammelt und bis zur Messung bei –30 °C gelagert. Die Konzentrationen von VEGF, HGF, FGF-2 und HMGB1 im Überstand wurden mit Quantikine Immunoassay Kits (R&D Systems) bzw. HMGB1 ELISA Kit Exp (SHINO-TEST CORPORATION, Kanagawa, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Die Eluatproben wurden hergestellt, indem jedes Zellblatt 24 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen in 200 μl DMEM (Thermo Fisher Scientific) ohne FBS getaucht wurde. Der Überstand wurde nach Zentrifugation (2460 × g, 4 °C, 5 Min.) gesammelt. Fibroblasten wurden in 96-Well-Platten mit 8000 Zellen/Well in 100 μl DMEM mit 10 % FBS ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 100 μl entweder der Eluatprobe oder DMEM ohne FBS. Jede Eluatprobe wurde zweifach mit DMEM mit 10 % FBS verdünnt und als Eluatprobe ohne Fibroblasten verwendet. Nach 48-stündiger Inkubation unter normoxischen Bedingungen wurde der Kulturüberstand zur Messung von VEGF und HGF gesammelt, gefolgt vom Zellproliferationstest. DMEM (100 μl) mit 5 % FBS, das 10 % WST-8-Reagenz (Cell Count Reagent SF) enthielt, wurde zu jeder Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang unter normoxischen Bedingungen inkubiert. Die Absorption des Überstands wurde bei 450 nm gemessen. Die Zellproliferationsrate wurde unter Verwendung der in DMEM kultivierten Fibroblasten als Kontrolle berechnet. Die Konzentrationen von VEGF und HGF im Kulturüberstand wurden durch ELISA gemessen und die Produktionsverhältnisse wurden nach der folgenden Formel berechnet: [(Überstand der mit der Eluatprobe kultivierten Fibroblasten) – (Überstand der Eluatprobe ohne Fibroblasten)]/(Überstand von mit DMEM kultivierten Fibroblasten). Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Trockene Eluatproben wurden nach dem gleichen Verfahren wie für die oben beschriebene Zellproliferationsanalyse hergestellt. DMEM mit rFGF-2 (0 oder 5 ng/ml, FUJIFILM Wako) wurde ebenfalls hergestellt. Diese Proben wurden 60 Minuten lang bei 37 °C mit dem neutralisierenden Anti-FGF-2-Antikörper (30,3 μg/ml, Nr. 05-117, Klon bFM-1, Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) oder dem Kontrollantikörper (Maus) inkubiert IgG1-Isotypkontrolle, Klon 11711; 30,3 μg/ml, MBA002, R&D Systems). Fibroblasten wurden in 96-Well-Platten mit 8000 Zellen pro Well in 100 μl DMEM mit 1 % FBS ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 100 μl entweder der Eluatprobe mit den Antikörpern oder DMEM mit rFGF-2 (0 oder 5 ng/ mL) mit Antikörpern. Nach einer 48-stündigen Inkubation unter normoxischen Bedingungen wurde der Kulturüberstand abgesaugt und der Zellproliferationstest durchgeführt. DMEM (100 μl) mit 0,5 % FBS, enthaltend 10 % Zellzahlreagenz SF, wurde in jede Vertiefung gegeben und 2 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen inkubiert. Die Absorption des Überstands wurde bei 450 nm gemessen. Die Zellproliferationsrate wurde unter Verwendung von in 0 ng/ml rFGF-2 kultivierten Fibroblasten mit dem Kontrollantikörper als Kontrolle berechnet. Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Männlichen C57BL/6N-Mäusen wurde an fünf aufeinanderfolgenden Tagen alle 24 Stunden intraperitoneal Streptozotocin (STZ; FUJIFILM Wako) in einer Menge von 55 mg/kg verabreicht. Mäuse mit Blutzuckerwerten von ≥ 300 mg/dl an den Tagen 9 und 10 nach der Verabreichung von STZ wurden als diabetische Mäuse klassifiziert. Bei den diabetischen Mäusen wurde am 14. Tag nach der letzten STZ-Gabe ein Hautgeschwür präpariert. Männliche C57BL/6N-Mäuse wurden mit 2 % Isofluran durch Inhalation anästhesiert und mit einer Biopsie-Stanze wurde ein 6 mm großer Hautdefekt in voller Dicke auf der Rückenhaut erzeugt (n = 6 pro Gruppe). Lebende Blätter und FT-Blätter wurden mit einer 1000-µL-Spitze mit breiter Bohrung auf den Hautdefekt übertragen, und trockene Blätter wurden mit einer Pinzette gehandhabt. Jedes Zellblatt wurde aus männlichen C57BL/6N-Mäusen (autolog) und männlichen C3H/He-Mäusen (allogen) hergestellt. Alle Wunden wurden mit ADAPTIC (#2012; Acelity, San Antonio, TX, USA) und Derma-aid® (ALCARE, Tokio, Japan) abgedeckt und in den ersten 24 Stunden mit Silkytex-Verband (#11893; ALCARE) fixiert. Am ersten Tag wurden alle Wunden mit Airwall Fuwari (# MA-E050-FT; Kyowa, Osaka, Japan) abgedeckt und mit einem Silkytex-Verband fixiert9. Jede Wunde wurde an den Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 mit einer Digitalkamera fotografiert. Jedes Foto wurde mit einem Durchmesser von 10,5 mm normalisiert und die Wundfläche wurde durch manuelles Nachzeichnen jeder Wunde gemessen Edge mithilfe der ImageJ-Software (NIH, Bethesda, MD, USA). Die Wundverschlussrate wurde wie folgt berechnet: [Tag X] (%) = {1 − (Wundfläche [Tag ) und innerhalb einer Woche nach der Vorbereitung für dieses Experiment verwendet.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Unterschiede wurden durch eine einseitige Varianzanalyse bewertet, gefolgt von entweder dem Tukey-Kramer-Test für mehrere Vergleiche zwischen Gruppen oder dem Dunnett-Test für Vergleiche mehrerer Gruppen mit einer Kontrollgruppe. Für einen statistischen Vergleich zwischen den beiden Gruppen wurde der Student-T-Test durchgeführt. Die Daten wurden in Statcel (Add-in-Software für Microsoft Excel, OMS Ltd., Japan) statistisch analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Yukari Hironaka und Kenzo Ikemoto für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (21K08845 an MY und 22K08960 an RS) und AMED unter der Grant-Nummer JP21lm0203008 (an KH) unterstützt.

Abteilung für Chirurgie und klinische Wissenschaft, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan

Yutaro Matsuno, Masashi Yanagihara, Koji Ueno, Toshiro Saito, Hiroshi Kurazumi, Ryo Suzuki, Shunsaku Katsura und Kimikazu Hamano

Abteilung für Molekulare Pathologie, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan

Atsunori Oga

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YM, MY, TS, KU, RS, SK und KH trugen zur Konzeption und Gestaltung der Experimente bei. YM, MY, HK und RS führten Experimente durch. YM, MY, KU, RS, AO und KH analysierten die Daten. YM, MY, HK und RS steuerten jeweils Reagenzien, Materialien und Analysewerkzeuge bei. YM, MY, RS, SK, AO und KH haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben die Ergebnisse besprochen und das Manuskript genehmigt.

Korrespondenz mit Masashi Yanagihara.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Matsuno, Y., Yanagihara, M., Ueno, K. et al. Trocken konservierte mehrschichtige Fibroblastenzellblätter sind ein neues handhabbares Werkzeug für die regenerative Medizin zur Förderung der Wundheilung. Sci Rep 12, 12519 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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Eingegangen: 09. März 2022

Angenommen: 08. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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