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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 418 (2023) Diesen Artikel zitieren
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Mit Ausnahme eines Zytokins der Interleukin (IL-)6-Familie teilen sich alle das Glykoprotein (gp) 130 als gemeinsame β-Rezeptorkette. Während das Interleukin (IL-)11-Signal über den nicht signalisierenden IL-11-Rezeptor (IL-11R) und gp130-Homodimere erfolgt, rekrutiert der Leukämie-Hemmfaktor (LIF) Heterodimere des gp130:LIF-Rezeptors (LIFR). Unter Verwendung von IL-11 als Gerüst tauschen wir die gp130-Bindungsstelle III von IL-11 mit der LIFR-Bindungsstelle III von LIF aus. Das resultierende synthetische Zytokimer GIL-11 rekrutiert effizient den nichtnatürlichen Rezeptorsignalkomplex bestehend aus gp130, IL-11R und LIFR, was zur Signaltransduktion und Proliferation faktorabhängiger Ba/F3-Zellen führt. Außer LIF und IL-11 aktiviert GIL-11 keine Rezeptorkomplexe, die aus gp130:LIFR bzw. gp130:IL-11R bestehen. Menschliches GIL-11 zeigt nach teilweiser Hepatektomie eine Kreuzreaktivität mit Mäusen und geretteten IL-6R-/-Mäusen, was zeigt, dass die Signalübertragung von gp130:IL-11R:LIFR eine wirksame Leberregeneration induziert. Mit der Entwicklung des Zytokimers GIL-11 entwickeln wir den funktionellen Aufbau des nicht-natürlichen Zytokinrezeptorkomplexes gp130:IL-11R:LIFR.
Fortschritte in unserem Verständnis der Bildung von Zytokinrezeptorkomplexen haben die Implementierung verschiedener Ansätze zum Aufbau nichtnatürlicher Zytokinrezeptorkomplexe durch Designer-Zytokine ermöglicht. Hierzu zählen Synthekine1, Neoleukine2 und chimäre Zytokine (Zytokimären)3 aber auch vollsynthetische Zytokinsysteme4. Synthekine sind Fusionen zweier dominant negativer Zytokinvarianten, bei denen jede Variante nur eine Rezeptoruntereinheit bindet1. Neoleukine rekapitulieren einige Aspekte der natürlichen Zytokine, haben jedoch ein völlig unabhängiges Gesamtdesign und eine völlig unabhängige Aminosäuresequenz2. Zytokimere basieren auf dem Gerüst eines natürlichen Zytokins mit mindestens einer Rezeptorerkennungsstelle, die von einem eng verwandten Zytokin ausgetauscht wurde3, ein Konzept, das bisher speziell auf die Zytokine vom IL-6-Typ Interleukin (IL-)6 und den ziliären neurotrophen Faktor angewendet wurde ( CNTF) im Zytokin IC73.
Zytokine vom IL-6-Typ umfassen IL-6, IL-11, IL-27, IL-30, IL-31, Leukämie-Hemmfaktor (LIF), Oncostatin M (OSM), CNTF, Cardiotrophin-1 (CT-1). , Cardiotrophin-ähnliches Zytokin (CLC) und Neuropoeitin5,6. Abgesehen von IL-31 induzieren alle Zytokine vom Typ IL-6 die Signaltransduktion über den gemeinsamen gp130-β-Rezeptor7,8, der Signalkaskaden einschließlich der JAK/STAT-, Ras/Map-Kinase- und Phosphatidylinositol-3-Kinase-Wege aktiviert8,9. Während IL-6 und IL-11 über gp130-Homodimere signalisieren, signalisieren die anderen Zytokine über gp130-Heterodimere. Beispielsweise rekrutieren CNTF und LIF den gp130:LIF-Rezeptor (LIFR)10,11,12. Darüber hinaus müssen die Zytokine vom IL-6-Typ IL-6, IL-11 und CNTF mit spezifischen α-Rezeptoren (IL-6R, IL-11R bzw. CNTFR) interagieren, um die Bindung an β-Rezeptoren zu ermöglichen10,11,13 ,14,15.
In der bahnbrechenden Arbeit von 1993 haben Kallen et al. schlugen vor, dass sich die Rezeptorerkennungsstellen von Zytokinen als diskontinuierliche Module entwickelt haben, die grundsätzlich frei zwischen verschiedenen Zytokinen austauschbar sein sollten. Im Allgemeinen haben Zytokine vom Typ IL-6 im Fall von LIF zwei oder im Fall von IL-11 oder CNTF drei Rezeptorbindungsstellen, die Stelle I für den α-Rezeptor, die Stelle II und die Stelle III für die beiden β-Rezeptoren10,11 ,12. Durch die Übertragung der LIFR-Bindungsstelle III von CNTF16 auf die Bindungsstelle III von IL-6 wurde vor mehr als 20 Jahren das erste Zytokimer IC7 seiner Art beschrieben3. Die Abkürzung IC7 stammt von der siebten getesteten chimären Interleukin/CNTF-Variante. Der Modultausch erzeugte ein Mash-up-Zytokin mit IL-6R-abhängiger Aktivität auf Zellen, die gp130, IL-6R und LIFR exprimieren, anstatt im Fall von IL-6 von IL-6R und gp130 oder im Fall von IL-6 von gp130, CNTFR und LIFR abhängig zu sein im Fall von CNTF3. Kürzlich wurde gezeigt, dass IC7 die Glukosetoleranz und Hyperglykämie verbessert und dadurch Gewichtszunahme und Lebersteatose bei Mäusen verhindert17. Neben IC7 zeigten auch andere Zytokine der IL-6-Zytokinfamilie schützende Wirkungen gegen Fettleibigkeit und Insulin, darunter IL-618, IL-2719 und CNTF20. Ein therapeutischer Einsatz von IL-6 kommt jedoch aufgrund seiner ausgeprägten proinflammatorischen Wirkung nicht in Frage. Die CNTF-Variante Axokine scheiterte an der frühen Entwicklung neutralisierender CNTF-Antikörper21. IC7 kombinierte das Beste aus beiden Welten und zeigte keine Sicherheitsprobleme bei nichtmenschlichen Primaten17.
Hier haben wir das Zytokimer GIL-11 entwickelt, das den nicht-natürlichen Rezeptorkomplex bestehend aus gp130:IL-11R:LIFR bindet. Wir verwendeten IL-11 als Rückgrat für die Übertragung der Stelle III von LIF, was zur Zytokimera GIL-11 führte. Das hochaktive GIL-11 vereint die Aktivitäten von LIF22,23 und IL-1124 in einem Molekül. Bemerkenswert ist, dass der schützende Beitrag von IL-11 bei Lebererkrankungen kürzlich in Frage gestellt wurde25,26, was die therapeutische Anwendung von IL-11 unerwünscht macht. Um das therapeutische Potenzial von GIL-11 zu demonstrieren, verwendeten wir IL-6R-/-Mäuse, denen eine partielle Hepatektomie (PHX) unterzogen wurde. IL-6R-/-Mäuse zeigten nach PHX27 eine hohe Sterblichkeitsrate von bis zu 80 % gegenüber 10 % bei Wildtyp-Mäusen. Hier haben wir gezeigt, dass GIL-11 Mäuse nach einer teilweisen Hepatektomie vor dem Tod rettete.
Die Zytokine vom IL-6-Typ haben eine gemeinsame Vier-Helix-Bündelstruktur, die aus vier antiparallelen Alpha-Helices (A, B, C und D) besteht, die durch zwei lange Kreuzungsschleifen (AB, CD) und eine kurze Schleife verbunden sind (BC)28. IL-6, IL-11 und CNTF binden an ihren α-Rezeptor über die Bindungsstelle I, die Reste der C-terminalen AB-Schleife und der C-terminalen D-Helix umfasst10,11,13,14,15. Reste der A- und C-Helices von CNTF, LIF und IL-6 bilden eine gp130-Bindungsstelle, die als Stelle II10,11,12 bezeichnet wird. In IL-6 und IL-11 besteht eine zweite gp130-Bindungsstelle III aus Aminosäureresten der N-terminalen AB-Schleife, der C-terminalen CD-Schleife und der N-terminalen D-Helix10,11. Standort III in CNTF und LIF stellt den Kontakt zu LIFR her, während Standort II in Kontakt mit gp13012 steht. Für IL-11 stehen Standort II und Standort III in Kontakt mit gp130, während ein dritter Standort (Standort I) IL-11R11 rekrutiert. Insbesondere ist die primäre Bindung von IL-11 an IL-11R für die sekundäre Bindung an gp13011,29 zwingend erforderlich. Das Site-I-, II-, III-Paradigma für IL-11 und LIF ist in Abb. 1a, b dargestellt.
eine schematische Darstellung der Möglichkeiten des tetrameren und hexameren IL-11:IL-11R:gp130-Rezeptorkomplexes. IL-11 bindet zunächst über Stelle I an IL-11R. gp130 wird über Hauptinteraktionen zwischen Stelle III von IL-11 und D1 (Ig-ähnlich) von gp130 und Stelle II von IL-11 und D2/D3 in diesen Komplex rekrutiert ( Zytokinbindungsmodul (CBM) von gp130. b schematische Darstellung des trimeren LIF:gp130:LIFR-Komplexes. LIF bindet über Stelle III an D3/D4 von LIFR und über Stelle II an D2/D3 von gp130. c schematische Darstellung des tetrameren GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR-Komplexes. GIL-11 bindet über Stelle III an D3/D4 von LIFR, über Stelle II an D2/D3 von gp130 und über Stelle I an D2/D3 von IL-11R. d schematische Darstellung (links) und Raumfüllungsmodell (rechts) des tetrameren GIL-11:IL-11R:LIFR:gp130 (PDB 6O4P;11 2Q7N;83 1P9M10). GIL-11 bindet über Stelle I an IL-11R, über Stelle II an gp130 und über Stelle III an LIFR. e Kombiniertes transparentes Raumfüllungs-/Bandmodell von GIL-11, rot: IL-11, grün: ausgetauschte Region durch LIF. f Strukturbasiertes schematisches Sequenz-Alignment von hIL-11 (PDB 6O4O11), hLIF (PDB 1PVH33) und dem resultierenden GIL-11. Die Reste der Standorte IIIa,b,c sind in grünen und roten Kästchen hervorgehoben.
Bemerkenswert ist, dass IL-6 und IL-11 tetramere und hexamere Rezeptorkomplexe bilden können, die aus einem Zytokin, einem α-Rezeptor und zwei gp130 oder zwei Zytokinen, zwei α-Rezeptoren und zwei gp13010,30 bestehen (Abb. 1a). Obwohl der tetramere Rezeptorkomplex hauptsächlich biologisch aktiv ist31, zeigten die Strukturen der Rezeptorkomplexe nur hexamere Anordnungen10,11. LIF signalisiert jedoch ausschließlich über einen trimeren Rezeptorkomplex, der aus LIF besteht, der über Stelle II mit einem gp130 und über Stelle III12,32 mit einem LIFR verbunden ist (Abb. 1b). Bemerkenswert ist, dass LIF keinen α-Rezeptor benötigt, um an seine β-Rezeptorkombination aus gp130 und LIFR12 zu binden. Die Bindung von LIF an LIFR wird jedoch durch eine identisch lokalisierte Bindungsstelle III in IL-11 zu gp130 erleichtert (Abb. 1b)12. Wir stellten die Hypothese auf, dass der strukturbasierte Austausch der geteilten Bindungsstelle III von menschlichem IL-11 mit der Stelle III von menschlichem LIF das resultierende chimäre Zytokin in einen Binder der nicht-natürlichen Zytokinrezeptorzusammensetzung gp130:IL-11R:LIFR umwandelt. eine Zytokinklasse, die wir Zytokimera GIL-11 nannten. Da die β-Rezeptorbindung von LIF unabhängig vom α-Rezeptor ist12, waren wir uns nicht sicher, ob die gp130:LIFR-Rekrutierung des chimären Zytokins GIL-11 IL-11R-abhängig sein wird (Abb. 1c, d). Die Strukturuntersuchung der Stelle III in IL-11 und LIF leitete das Design der Zytokimera GIL-11 mit dem Gerüst von IL-11 und einem Austausch der Stelle III von LIF11,33. IL-11 besteht aus 199 Aminosäuren. Wir haben die unterteilte Stelle III anhand der Aminosäuren 58–72 für IIIa, 111–128 für IIIb und 162–179 für IIIc lokalisiert. LIF hat 202 Aminosäuren mit einer unterteilten Stelle III, die sich aus den Aminosäuren 64–88 für IIIa, 119–138 für IIIb und 172–189 für IIIc befindet (Abb. 1d – f, ergänzende Abb. 1A). Wir entschieden uns dafür, die komplette Bindungsstelle von LIF auf IL-11 zu übertragen, obwohl dies zu etwas längeren GIL-11-Zytokimeren mit 211 Aminosäuren als dem ursprünglichen IL-11 führte. Molekulare Modellierungen legten nahe, dass die Übertragung der gesamten Aminosäureabschnitte der Site III die Gesamtarchitektur und Faltung des Zytokimers GIL-11 nicht beeinträchtigen sollte (Abb. 1d, e)11,12. Vergleichbar mit trimeren LIF:gp130:LIFR-Komplexen bildet GIL-11 nur tetramere GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR-Rezeptorkomplexe. Der tetramere Aufbau basiert auf den Anforderungen von GIL-11 für den LIFR. Während gp130 zwei Zytokin-Bindungsstellen in einem Rezeptormolekül aufweist, verfügt LIFR nur über eine Zytokin-Bindungsstelle. Das LIFR interagiert nur mit Stelle III von LIF/GIL-11, wohingegen gp130 Stelle II von LIF/GIL-11 kontaktiert. In dieser Einstellung bleibt die zweite Kontaktstelle in gp130 frei, da Stelle III von LIF/GIL-11 nicht mit gp130 interagieren kann (Abb. 1c) und die Bildung hexamerer 2xGIL-11:2xIL-11R:1xLIFR:1xgp130-Komplexe möglich ist ausgeschlossen.
Die Proliferation der murinen Prä-B-Zelllinie Ba/F3 ist IL-3-abhängig34. Nach der Einführung von humanem gp130 plus weiteren Familienrezeptoren (IL-6R, IL-11R35, 36, OSMR und LIFR (ergänzende Abbildung 1B, C)) verlagerte sich die Proliferation auf die entsprechende Zytokinrezeptorkombination vom Typ IL-6. Im Falle von Ba/F3-gp130-Zellen wird die Proliferation durch IL-11 und das lösliche IL-11R oder durch das entsprechende Fusionsprotein Hyper IL-11 (HIL-11)37 induziert, die zusätzliche Einführung von IL-11R macht diese Zellen zu IL -11 abhängig. Durch die Koexpression von gp130 und IL-6R reagieren diese Zellen auf IL-6. Ba/F3-Zellen, die gp130 und LIFR exprimieren, vermehren sich mit LIF und OSM, wohingegen gp130- und OSMR-exprimierende Ba/F3-Zellen auf OSM reagieren. Verwendung unseres Ba/F3-Zellrepertoires mit den acht verschiedenen Rezeptorkombinationen gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR, gp130:IL-6R:LIFR und gp130:IL-11R :LIFR haben wir die qualitativen Proliferationseigenschaften nach Zugabe von IL-11, HIL-11, OSM, LIF und GIL-11 bestimmt. Verwendung einer relativ hohen Konzentration von 500 ng/ml, um zunächst eine mögliche Rezeptor-Kreuzaktivierung zu beurteilen. GIL-11 induzierte spezifisch nur die Proliferation von Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen, nicht jedoch einer anderen getesteten Zelllinie, was darauf hindeutet, dass GIL-11 Signale über gp130:IL-11R:LIFR sendet (Abb. 2a, ergänzende Daten). ). Wie erwartet induzierte nur HIL-11 die Proliferation aller Ba/F3-Zelllinien, da sie alle gp130 exprimieren. Alle Ba/F3-Zellen, die gp130 und IL-11R exprimierten, vermehrten sich mit IL-11. Die Expression von gp130 und LIFR führte zu einer LIF- und OSM-induzierten Proliferation, wohingegen Zellen, die gp130 exprimierten, und OSMR-Zellen OSM-selektiv waren. Als nächstes analysierten wir die Phosphorylierung von STAT3, dem Hauptmerkmal der JAK/STAT-Signalübertragung des IL-6-Typ-Zytokins in unserem Ba/F3-Zellportfolio. Wie aus den Zytokin-induzierten Ba/F3-Zellproliferationstests (Abb. 2a) zu erwarten war, wurde die STAT3-Phosphorylierung in Ba/F3-Zellen durch die folgenden Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Kombinationen induziert: HIL-11 über gp130; IL-11 über gp130:IL-11R; OSM über gp130:OSMR; OSM und LIF über gp130:LIFR (Abb. 2b; ergänzende Abb. 2, 3). Wichtig ist, dass eine anhaltende STAT3-Phosphorylierung für GIL-11 nur in Ba/F3-Zellen beobachtet wurde, die die Rezeptorkombination gp130, IL-11R und LIFR exprimierten (Abb. 2b; ergänzende Abb. 2, 3). Zusammenfassend zeigten unsere Daten auch, dass GIL-11 die Signalübertragung spezifisch über den nicht-natürlichen Rezeptorkomplex bestehend aus gp130:IL-11R:LIFR aktivierte.
a Verbreitung von Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130-IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Ba/F3 -gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R Zellen ohne Zytokin (-), mit 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 50 ng/ml IL- 6, 10 ng/ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11. Die Daten stellen ±SEM von drei unabhängigen Experimenten von drei mit jeweils drei technischen Replikaten dar. Für die Statistik wurde eine Zwei-Wege-ANOVA einschließlich der Dunnet-Korrektur verwendet. b STAT3-Aktivierung in Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130_IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R Zellen ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11 für 15 Min. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten.
Um das Transkriptionsprofil von GIL-11 zu bewerten, wurden Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen 40 Minuten lang mit GIL-11, IL-11 oder LIF mit 100-fachen EC50-Konzentrationen stimuliert, um maximale Signaltransduktion und Vergleichbarkeit sicherzustellen zur Transkriptomanalyse. Das Venn-Diagramm zeigt, dass 37 Gene durch GIL-11, IL-11 und LIF mindestens 1,5-fach hochreguliert wurden (Abb. 3a, b). Interessanterweise wurden 31 Gene durch IL-11 und LIF mindestens 1,5-fach hochreguliert, nicht jedoch durch GIL-11. Insgesamt wurden 52 Gene durch IL-11 und/oder LIF hochreguliert, nicht jedoch durch GIL-11, was darauf hindeutet, dass GIL-11 im Vergleich zu IL-11 oder LIF zu einer abgeschwächten Transkription führt. Die Analyse der genontologischen Anreicherung zeigt, dass mehrere Gene, die an Entzündungsreaktionen oder Hämatopoese beteiligt sind, durch GIL-11, IL-11 und LIF hochreguliert werden (Abb. 3c, d). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass sich das Transkriptionsmuster von GIL-11 geringfügig von den natürlichen Zytokinen IL-11 und LIF unterscheidet.
Ein Venn-Diagramm zeigt die Überlappung von Genen, die durch natürliche oder synthetische Zytokine aktiviert werden. Filter: p < 0,05 einschließlich Korrektur der Falscherkennungsrate; |FC| ≥ 1,5. b Die Wärmekarte zeigt Gene, die durch GIL-11 gegenüber unbehandelt, IL-11 gegenüber unbehandelt und LIF gegenüber unbehandelt signifikant erhöht sind. Die Maßstabsleiste zeigt die logarithmische Faltungsänderung. Filter: p < 0,05 einschließlich Korrektur der Falscherkennungsrate; |FC| ≥ 1,5 Genontologische Analyse häufiger Genwege, die durch GIL-11, LIF und IL-11 (c) und nur durch die natürlichen Zytokine (d) aktiviert werden. Filter: p < 0,05 einschließlich Korrektur der Falscherkennungsrate; |FC| ≥ 1,5. X-Achse: Anzahl der Gene, die am gemeinsamen Genweg beteiligt sind. Genexpressions-Zugangscode: GSE226064.
Als nächstes führten wir eine dosisabhängige Proliferation durch, um die Qualität und Kapazität von GIL-11 zu bestimmen. Auch hier induzierte GIL-11 selbst bei der höchsten angewandten Konzentration von 500 ng/ml keine Proliferation von Ba/F3-Zellen, die gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR exprimierten. wohingegen die Proliferation von Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen mit einem EC50 von 1,44 ng/ml eindeutig dosisabhängig war (Abb. 4a; ergänzende Daten). Zum Vergleich haben wir den EC50-Wert für LIF und IL-11 auf Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen auf 0,074 ng/ml und 0,72 ng/ml bestimmt (Abb. 4b, c; ergänzende Daten). Zur Analyse der STAT3- und ERK-Phosphorylierung wurden Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen mit zunehmenden Mengen an GIL-11, IL-11 und LIF stimuliert. Western Blot zeigte, dass 10–100 ng/ml GIL-11 und IL-11 erforderlich waren, um eine maximale STAT3- und ERK-Phosphorylierung zu erreichen, wohingegen die biologische Aktivität von LIF mit 0,1–1 ng/ml höher war, die für eine maximale STAT3-Phosphorylierung erforderlich waren (Abb . 4d, Ergänzende Abb. 4). Im Hinblick auf die Aktivierung der anderen STATs in Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen wurde die Phosphorylierung von STAT1, 3, 5 und 6 nach Stimulation mit HIL-11, IL-11, OSM, LIF und bewertet GIL-11. Über gp130 aktivieren alle Zytokine vom Typ IL-6 effizient STAT3, jedoch nur in geringem Maße STAT1 und STAT5. Bei LIF und OSM, STAT3 und STAT1 sowie STAT5 wurde eine Aktivierung beobachtet38. Hier induzierten alle Zytokine eine anhaltende STAT3-Phosphorylierung. Interessanterweise induzierten HIL-11 und IL-11 keine STAT1- und STAT5-Phosphorylierung, wohingegen LIF, OSM und GIL-11 auch die STAT1-Phosphorylierung induzierten (Abb. 4e, ergänzende Abb. 6; 2c, d). Eine STAT5-Phosphorylierung wurde nur für GIL-11 beobachtet. Wie erwartet induzierte keines der Zytokine die STAT6-Phosphorylierung. Als nächstes stimulierten wir Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R-Zellen mit IL-11, LIF und GIL-11 für 5–240 Minuten. Die STAT3-Phosphorylierung beginnt 5 Minuten nach der Zytokinstimulation und erreicht ihren Höhepunkt nach 30–60 Minuten. Wie typischerweise bei IL-11 und LIF beobachtet, nimmt die STAT3-Phosphorylierung nach 120–240 Minuten ab, was wahrscheinlich auf die Hochregulierung von SOCS339 zurückzuführen ist (vergleiche Abb. 3b, transkriptomische Analyse, SOCS3-Hochregulierung um das 10,5-fache von GIL-11, 18,4-fach IL-11). 11, 14,5-facher LIF), wurde die gleiche Regulation der STAT3-Phosphorylierung für das Zytokin GIL-11 beobachtet (Abb. 4f, ergänzende Abb. 7). Insgesamt liegt die Aktivität von GIL-11 im gleichen Konzentrationsbereich wie das Vorläufer-Zytokin IL-11, was zeigt, dass die Ausweitung des Rezeptorbedarfs durch Site-III-Transfer keinen Einfluss auf die gesamte biologische Zytokinaktivität hatte.
a Verbreitung von Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130:IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR , Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit steigender Konzentrationen von GIL-11 (0,0005–500 ng/ml). b Proliferation von Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit steigender LIF-Konzentrationen (0,000025–200 ng/ml). c Proliferation von Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit steigender Konzentrationen von IL-11 (0,000025–500 ng/ml). a–c Fehlerbalken definieren ±SEM. Gezeigt wird ein repräsentatives Experiment mit drei von drei biologischen Replikaten. d STAT3- und ERK-Aktivierung in Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R-Zellen ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit steigenden Mengen an GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) und IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) für 15 Minuten. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3, STAT3, ERK und Phospho-ERK analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten. e STAT1,3,5,6-Aktivierung in Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11 für 15 Min. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STATs und STATs analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten. f Zeitabhängige STAT3-Aktivierung von Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR-Zellen mit den Zytokinen IL-11 (200 ng/ml), LIF (20 ng/ml) und GIL-11 (200 ng/ml) für die angegebene Zeit. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert.
Die α-Rezeptor-abhängigen Zytokine IL-6 und IL-11 aktivieren Zellen über den signaltransduzierenden Rezeptor gp130 und das nicht signalgebende membrangebundene IL-6R bzw. IL-11R37,40. Hier zeigten wir GIL-11-Signale über das membrangebundene IL-11R im Komplex mit dem heterodimeren gp130:LIFR-Komplex. Die Signalübertragung über das membrangebundene IL-11R wird als klassische Signalübertragung bezeichnet. Der IL-11R existiert auch als löslicher Rezeptor, der im Komplex mit IL-11 Zellen aktiviert, denen die membrangebundene α-Rezeptorexpression fehlt, in einem Prozess, der Transsignalisierung genannt wird37,40. Hier analysierten wir, inwieweit GIL-11 im Komplex mit löslichem IL-11R (sIL-11R) die Transsignalisierung auf Zellen induzierte, die gp130 und LIFR exprimierten. Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen wurden mit einer festen Konzentration von 100 ng/ml sIL-11R und steigenden Konzentrationen von GIL-11 (2–2000 ng/ml) stimuliert. Zum Vergleich verwendeten wir die gleiche feste Konzentration von sIL-11R und steigende Zytokinkonzentrationen für IL-11. Während der EC50-Wert für IL-11 bei 100 ng/ml sIL-11R 71,6 ng/ml betrug (Abb. 5a; ergänzende Daten), induzierte GIL-11 kaum eine Proliferation über sIL-11R. Es war nicht möglich, einen EC50-Wert zu berechnen, da selbst die Konzentration von 2000 ng/ml GIL-11 nicht ausreichte, um eine maximale Zellproliferation zu erreichen (Abb. 5b; ergänzende Daten). Daher untersuchten wir die intrazelluläre Signaltransduktion in Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen, die mit vergleichsweise hohen Konzentrationen von 1 µg/ml GIL-11 und 2 µg/ml sIL-11R stimuliert wurden. Hier führten GIL-11:sIL-11R-Komplexe zu einer anhaltenden STAT3-Aktivierung. sgp130Fc ist ein selektiver IL-6/IL-11-Transsignalisierungsinhibitor, der die LIF-Signalisierung mindestens 100–1000-fach weniger effizient hemmt als die IL-6/IL-11-Transsignalisierung40,41. Als nächstes testeten wir, ob sgp130Fc die GIL-11-Transsignalisierung hemmt. Wie in Abb. 5c, ergänzende Abb. 8 gezeigt, hemmte sgp130Fc (10 µg/ml) nicht die durch GIL-11 (1 µg/ml):sIL-11R (2 µg/ml) Transsignalisierung in Ba induzierte STAT3-Phosphorylierung /F3-gp130:LIFR-Zellen (Abb. 5c, ergänzende Abb. 8). Für Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen wurden Konzentrationen für GIL-11 (0,5 µg/ml) oder IL-11 (0,5 µg/ml) plus sIL-11R (1 µg/ml) gewählt, um die Zellproliferation über trans- Signalisierung. Die Titration steigender Konzentrationen von sgp130Fc führte zur Hemmung der IL-11-Transsignalisierung (IC50 = 22,5 ng/ml, Abb. 5d; ergänzende Daten), wohingegen selbst die höchste Konzentration von 10 µg/ml sgp130Fc nicht in der Lage war, GIL zu hemmen -11 Transsignalisierung. Grundsätzlich ist GIL-11 in der Lage, Signale über Transsignalisierung zu übertragen, allerdings mit einer deutlich geringeren Effizienz im Vergleich zu IL-11. Wie LIF wird auch die GIL-11-Transsignalisierung durch sgp130Fc nicht gehemmt, zumindest nicht unter Bedingungen, die ausreichen, um die IL-11-Transsignalisierung zu blockieren37,40,41. Wie in Abb. 2a gezeigt, wurde die Proliferation von Ba/F3-gp130:LIFR und Ba/F3-gp130:IL-11R durch LIF bzw. IL-11 induziert, nicht jedoch durch GIL-11. Wir konnten jedoch nicht ausschließen, dass GIL-11 an IL-11R:gp130 auf Ba/F3-gp130:IL-11R-Zellen bindet und die IL-11-Signalübertragung blockiert, oder an LIFR auf Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen und blockiert LIF Signalisierung. Die Verwendung einer Zytokin-Co-Inkubation für Ba/F3-gp130:IL-11R mit IL-11 und GIL-11 und für Ba/F3-gp130:LIFR mit LIF und GIL-11 führte selbst bei 20 nicht zu einer Hemmung der Zellproliferation -facher Massenkonzentrationsüberschuss von GIL-11 gegenüber IL-11 und ein 200-facher GIL-11-Überschuss gegenüber LIF (Abb. 5e; ergänzende Daten). Wir kommen zu dem Schluss, dass GIL-11 die IL-11- und LIF-Signalübertragung zumindest im getesteten Konzentrationsbereich nicht beeinträchtigte.
a Proliferation von Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit fester Konzentrationen von sIL-11R (0 oder 100 ng/ml) und steigender Konzentrationen von IL-11 (1–2000 ng/ml). Gezeigt wird eines von drei repräsentativen Experimenten. b Proliferation von Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit fester Konzentrationen von sIL-11R (0 oder 100 ng/ml) und steigender Konzentrationen von GIL-11 (1–2000 ng/ml). Gezeigt wird eines von drei repräsentativen Experimenten. c STAT3-Aktivierung in Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit HIL-11 (50 ng/ml), GIL-11 (1 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml) :sIL-11R (2 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml):sIL-11R (2 µg/ml):sgp130Fc (10 µg/ml) für 15 Min. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten. d Proliferation von Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit festgelegter Konzentrationen von IL-11 (0,5 µg/ml):sIL-11R (1 µg/ml) oder GIL-11 (0,5 µg/ml): sIL-11R (1 µg/ml) und steigende Konzentrationen von sgp130Fc (1–10.000 ng/ml). Gezeigt wird eines von drei repräsentativen Experimenten. e Proliferation von Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit fester Konzentrationen von LIF (10 ng/ml) und steigender Konzentrationen von GIL-11 (1–2000 ng/ml) (grün). Proliferation von Ba/F3-gp130:IL-11R-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit fester Konzentrationen von IL-11 (100 ng/ml) und steigender Konzentrationen von GIL-11 (1–2000 ng/ml) (rot). Fehlerbalken definieren ±SEM. Gezeigt wird ein repräsentatives Experiment mit drei von drei biologischen Replikaten.
Menschliches IL-11 und LIF sind kreuzreaktiv zwischen Mäusen und Männern42,43,44. Wir haben analysiert, ob menschliches GIL-11 auch Mauszellen aktiviert, die Maus-gp130:IL-11R:LIFR-Ketten exprimieren. Wir haben uns für die murine Myoblastenzelllinie C2C12 entschieden. C2C12-Zellen wurden mit humanem HIL-11 (200 ng/ml), humanem IL-11 (200 ng/ml), humanem LIF (10 ng/ml) und GIL-11 (200 ng/ml) stimuliert. HIL-11 und LIF induzierten eine anhaltende STAT3-Phosphorylierung, wohingegen IL-11 und GIL-11 dies nicht taten, was darauf hindeutet, dass C2C12-Zellen gp130 und LIFR exprimieren, aber die Expression von IL-11R fehlt (Abb. 6a, ergänzende Abb. 9). Wir transfizierten C2C12-Zellen mit einem Plasmid, das für murinen IL-11R-cDNA kodiert. Dies führt zur mIL-11R-Expression, wodurch diese Zellen auf IL-11 und GIL-11 reagieren, wie durch STAT3-Phosphorylierung gezeigt (Abb. 6a, ergänzende Abb. 9). Wir stimulierten auch embryonale Fibroblastenzellen der Linie NIH/3T3 der Maus mit 1, 10, 100 und 1000 ng/ml menschlichem GIL-11, IL-11 und 0,1, 1, 10 und 100 ng/ml LIF. LIF und IL-11 induzierten die STAT3-Phosphorylierung in NIH/3T3, wie durch Western Blot gezeigt (Abb. 6b, ergänzende Abb. 10), da diese Zellen gp130, LIFR und IL-11R45 exprimieren. Die dosisabhängige Zellstimulation zeigte, dass 10–100 ng/ml GIL-11 und IL-11 erforderlich waren, um eine anhaltende STAT3-Phosphorylierung in murinem NIH/3T3 zu erreichen. Als nächstes injizierten wir Wildtyp-Mäusen 5, 10 und 20 µg GIL-11 intraperitoneal. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Mäuse getötet und Herz-, Leber- und Milzgewebe entfernt. Die Analyse der STAT3-Phosphorylierung durch Western Blot zeigte, dass mindestens 10 µg/Maus GIL-11 ausreichten, um eine anhaltende STAT3-Phosphorylierung in Herz, Leber und Milz zu induzieren (Abb. 6c, ergänzende Abb. 11). Zusammengenommen zeigten unsere Daten, dass menschliches GIL-11 die murine Rezeptorkombination gp130:IL-11R:LIFR aktiviert.
eine STAT3-Aktivierung in nicht transfizierten und mit einer cDNA transfizierten, die für murinen IL-11R-Mausmyoblasten (C2C12) kodiert, ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit HIL-11 (200 ng/ml), IL-11 (200 ng/ml). ), LIF (10 ng/ml), GIL-11 (200 ng/ml) für 15 Min. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten. b STAT3-Aktivierung in murinen Fibroblasten NIH/3T3 ohne Zytokin (-) und nach Stimulation mit steigenden Mengen an GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) und IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) für 20 Minuten. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten. c STAT3-Aktivierung in Herz, Leber und Milz nach Injektion von 5, 10 oder 20 µg/ml GIL-11. Die Mäuse wurden 30 Minuten nach der intraperitonealen Zytokininjektion getötet. Gleiche Proteinmengen (50 µg/Spur) wurden über spezifische Antikörper zum Nachweis von Phospho-STAT3 und STAT3 analysiert. Western-Blot-Daten zeigen eines von drei repräsentativen Experimenten.
Interleukin-6 (IL-6) ist entscheidend an der Leberregeneration nach partieller Hepatektomie (PHX) beteiligt. IL-6−/−- und IL-6R−/−-Mäuse weisen eine hohe Sterblichkeitsrate von 40–80 % gegenüber 10 % bei Wildtyp-Mäusen auf, begleitet von einer verminderten STAT3-Phosphorylierung und einer verminderten Proliferation von Hepatozyten27,46,47,48,49 .50 folgte PHX. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Injektion von Hyper IL-6 (HIL-6) 24 Stunden vor und direkt nach der Operation Mäuse vor dem Tod nach teilweiser Hepatektomie rettete51. Hier wurden 10 µg/Maus GIL-11 24 Stunden vor und direkt nach PHX in IL-6R-/-Mäuse injiziert. Die Gesamtüberlebensrate von IL-6R-/-Mäusen 9 Tage nach PHX betrug etwa 40 %, wohingegen IL-6R-/-Mäuse, denen zwei Dosen GIL-11 injiziert wurden, eine Überlebensrate von 90 % hatten (Abb. 7a; Ergänzung). Daten). Wie zuvor gesehen27, unterschied sich das Körpergewicht 9 Tage nach PHX bei überlebenden IL-6R-/-Mäusen nicht, unabhängig davon, ob ihnen GIL-11 oder PBS injiziert wurde, wohingegen das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht leicht verringert war (Abb. 7b, c; Zusatzdaten). Wir stellten jedoch fest, dass unbehandelte IL-6R-/-Mäuse im Vergleich zu mit GIL-11 behandelten IL-6R-/-Mäusen ein größeres Milzgewicht hatten (Abb. 7d; ergänzende Daten). Die Genexpressionsanalyse zeigte eine erhöhte Expression des fibrotischen Markers αSMA und des Akute-Phase-Response-Gens SAA1 in mit GIL-11 behandelten IL-6R-/-Mäusen im Vergleich zu unbehandelten IL-6R-/-Mäusen direkt nach PHX (Abb. 7e; ergänzende Daten). . Zusammenfassend zeigten unsere Daten, dass GIL-11 IL-6R-/-Mäuse nach einer teilweisen Hepatektomie vor dem Tod rettete.
a IL-6R-/-Mäuse wurden 70 % PHX ausgesetzt, denen jeweils 20 µg PBS (n = 11) oder GIL-11 (n = 11) injiziert wurden, 24 Stunden vor und direkt nach der Operation, und das Überleben wurde für 9 überwacht Tage. b Das Körpergewicht von IL-6R-/-Mäusen, die mit und ohne GIL-11 nach 70 % PHX behandelt wurden, wurde 12 Tage nach PHX bestimmt (n = 4 unbehandelt, n = 5 GIL-11). c Das Leber-/Körpergewichtsverhältnis von IL-6R-/-Mäusen, die mit und ohne GIL-11 nach 70 % PHX behandelt wurden, wurde 9 Tage nach PHX bestimmt (n = 5 unbehandelt, n = 7 GIL-11). d Das Milzgewicht von IL-6R-/-Mäusen, die mit und ohne GIL-11 nach 70 % PHX behandelt wurden, wurde 9 Tage nach PHX bestimmt (n = 5 unbehandelt, n = 7 GIL-11). e Die Gesamt-RNA wurde aus der Leber direkt nach PHX von IL-6R-/-Mäusen extrahiert, die zuvor mit und ohne GIL-11 behandelt worden waren, und der mRNA-Spiegel von aSMA, SAA1, Ki67, EGF, CycA2 und G0S2 wurde durch quantitative PCR bestimmt (n = 6). b–e Jeder Punkt stellt Daten dar, die von einer Maus stammen. Fehlerbalken sind ±SEM.
Unsere Experimente definieren ein menschliches chimäres Designer-Zytokin, das familientypische JAK/STAT-Signalisierung und Zellproliferation über den nicht-natürlichen gp130:IL-11R:LIFR-Komplex mit speziesübergreifender Spezifität von der Maus bis zum Menschen induziert. Durch den Austausch der Stelle III von LIF zu IL-11 entsteht das Zytokimer GIL-11 mit Rezeptorbindungseigenschaften, die bisher in der Natur nicht vorkommen. Der Prototyp der Zytokimera IC7, basierend auf dem IL-6-Gerüst mit Standort III von CNTF, diente als Blaupause für GIL-113. IC7 und GIL-11 zeigten, dass das Gesamtgerüst innerhalb der Zytokinfamilie vom IL-6-Typ aufgrund einer allgemeinen modularen Architektur austauschbar ist. Da die Übertragung auf den Standort III beschränkt ist, bleibt abzuwarten, ob auch die Übertragung von Standort I und Standort II möglich sein wird. Als zweiter seiner Art verfügt GIL-11 über einzigartige Merkmale, die ihn vom IC7 unterscheiden. Zunächst rekrutiert IC7 den Rezeptorkomplex gp130:IL-6R:LIFR, während GIL-11 gp130:IL-11R:LIFR zusammenstellt, was bedeutet, dass nur die Zellen, die IL-11R exprimieren, von GIL-11 angegriffen werden. Dies könnte ein wichtiges Thema im Hinblick auf die Zellspezifität in vivo sein. Während der gemeinsame β-Rezeptor gp130 ubiquitär exprimiert wird, ist die Expression von LIFR und auch der α-Rezeptoren eingeschränkt und daher zelltypspezifischer. Im Gegensatz zu IL-6R, das hauptsächlich auf Immunzellen und Hepatozyten vorkommt52,53, scheint die Verteilung von membrangebundenem IL-11R ausgewogener zu sein54, einschließlich Kardiomyozyten55, Fibroblasten56 und Epithelzellen57.
Aufgrund ihres begrenzten Expressionsprofils verleihen die α-Rezeptoren IL-6R, IL-11R und CNTFR eine zweite Schicht zellulärer Spezifität6. Wir gehen davon aus, dass die Rekrutierung synthetischer Komplexe letztendlich zu einem Funktionsgewinn in der Zellspezifität führt und dadurch positive Auswirkungen bei In-vivo-Anwendungen von Designer-Zytokinen in der synthetischen Biologie begünstigen und negative Auswirkungen verringern könnte. Bemerkenswert ist, dass IC7Fc selektiv Stoffwechselwege aktiviert, was zu einer erhöhten Fettsäureoxidation, begleitet von einer verhinderten Steatose, einer erhöhten Energiedissipation, begleitet von Gewichtsverlust, Muskelhypertrophie und dem Erhalt von Muskelmasse mit verbesserter Knochenstabilität bei Mäusen führt17. Im Gegensatz zu IL-6 und CNTF hat sich die IC7-Injektion sowohl bei Mäusen als auch bei nichtmenschlichen Primatenmakaken als sicher erwiesen, ohne übermäßige Entzündungsreaktionen zu fördern3,17,58.
Darüber hinaus wurde angenommen, dass das transkriptomische Profil von GIL-11 mit LIF übereinstimmt, da beide die gp130- und LIFR-Heterodimere rekrutieren und aktivieren, während IL-11 gp130-Homodimere rekrutiert. Interessanterweise wirkte GIL-11 eher zwischen IL-11 und LIF, allerdings in abgeschwächter Form. Es wurde vorgeschlagen, dass die Geometrie und Affinität des Ligand-Rezeptor-Komplexes für die funktionelle Vielfalt bestimmter Zytokine vom IL-6-Typ verantwortlich sein könnten59. Das Fehlen der Fähigkeit von GIL-11 zur Genexpression könnte von Vorteil sein. Smad7 ist ein negativer Regulator der TGF-ß-Signalübertragung und scheint an der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen (IBDs), einschließlich Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), beteiligt zu sein und vermittelt Darmentzündungen60. Es wurde gezeigt, dass eine Überexpression von MyD88 die Herzfunktion beeinträchtigt und zu kardiovaskulären Autoimmunerkrankungen beiträgt61,62,63. Es wird angenommen, dass Arid5a zum Zytokinsturm beiträgt. Darüber hinaus sind Arid5a−/− Mäuse resistent gegenüber Endotoxinschock, Bleomycin-induzierter Lungenschädigung und entzündlicher Autoimmunerkrankung64.
Zweitens sind die natürlichen Zytokine IC7, IL-6 und CNTF von der α-Rezeptorbindung abhängig, bevor sie an gp130 und LIFR3 binden, was bedeutet, dass die Formung der CNTF-abgeleiteten Bindungsstelle III in IC7 eine direkte Folge der IL-6R-Bindung ist nach Bindung von CNTF an CNTFR. Bei GIL-11 ist die Situation anders. Hier haben wir die α-Rezeptor-unabhängige Bindungsstelle III von LIF in das α-Rezeptor-abhängige IL-11 eingeführt. Wie hier gezeigt, aktiviert GIL-11 den gp130:LIFR-Rezeptorkomplex erst nach der Bindung an den nicht signalübertragenden IL-11R. Darüber hinaus war GIL-11 nicht in der Lage, die LIF-Signalübertragung auf Ba/F3-gp130:LIFR-Zellen zu hemmen, was der Fall sein sollte, wenn GIL-11 in Abwesenheit von IL-11R an LIFR binden kann. Insgesamt zeigten unsere Experimente, dass, obwohl der ursprüngliche Bindungsstellenkontext der LIF-Stelle III zu LIFR vom α-Rezeptor unabhängig ist, die Neuformatierung der LIF-Stelle III in das IL-11-Gerüst die Bindung des LIF-Stelle III an den α-Rezeptor abhängig macht . Daher definiert nicht die genaue Aminosäurezusammensetzung der Bindungsstelle III, sondern vielmehr die durch α-helikale Verschiebungen der Stelle I mit der Stelle III vermittelte Verbindung, ob ein Zytokin vom α-Rezeptor abhängig oder unabhängig ist65.
Hinsichtlich der biologischen Aktivität ist GIL-11 (EC50: 1,44 ng/ml) vergleichbar mit IL-11 (EC50: 0,72 ng/ml), aber weniger wirksam als LIF (EC50: 0,074 ng/ml). Dies könnte eher auf dem dominanten Gerüsteffekt von IL-11 als auf dem geringfügigen Standort-III-Austauscheffekt von LIF beruhen. Die biologische Aktivität von GIL-11 könnte jedoch durch die D186A-Mutation an Stelle I erhöht werden, da bekannt ist, dass dieser Aminosäureaustausch die Affinität von IL-11 zu IL-11R66 erhöht. Die Verbesserung der Zytokinbindung an den α-Rezeptor ist eine gängige Strategie zur Verbesserung der Gesamtaktivität in dieser Zytokinfamilie, wie auch für CNTF an CNTFR67 und IL-6 an IL-6R68 gezeigt wurde.
Nachdem wir die biologische Aktivität und die einzigartige Rezeptorzusammensetzung von GIL-11 charakterisiert haben, haben wir die Fähigkeit von GIL-11 untersucht, IL-6 während der Leberregeneration nach PHX in IL-6R-/-Mäusen funktionell zu ersetzen. Wir und andere haben zuvor gezeigt, dass IL-6 und IL-6R entscheidend an der Leberregeneration nach PHX beteiligt sind, was zu einer höheren Mortalität bei IL-6R-/-Mäusen führt27,46,47,48,49,50. Wichtig ist, dass HIL-6 Mäuse vor dem Tod nach einer teilweisen Hepatektomie rettete51. Darüber hinaus beschleunigt die kombinierte Injektion von IL-6 und löslichem IL-6R (sIL-6R), jedoch nicht von IL-6 allein, bei Wildtyp-Mäusen die Leberregeneration nach PHX69. Da Hepatozyten wahrscheinlich viel mehr gp130 als IL-6R exprimieren, führt das erhöhte Vorhandensein von IL-6 und sIL-6R zu einer stärkeren gp130-Aktivierung und einer stärkeren IL-6-Signalisierung im Vergleich zu IL-6 allein70. Schließlich führt die Blockade der IL-6-Transsignalisierung durch sgp130Fc zu einer erhöhten Mortalität nach PHX27. Mechanistisch gesehen trug die durch IL-6-Transsignale induzierte Produktion des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) durch hepatische Sternzellen direkt zur Leberregeneration nach PHX27 bei. Da den in dieser Arbeit verwendeten IL-6R-/−-Mäusen die Expression von IL-6R fehlt, sind sowohl die klassische als auch die Transsignalisierung deaktiviert. Daher weisen sie eine Sterblichkeitsrate von 90 % gegenüber 10 % bei Wildtyp-Mäusen auf27. Ein entscheidender Unterschied zwischen der Behandlung mit GIL-11 und HIL-6 besteht darin, dass GIL-11 nur auf Zellen abzielt, die gp130:IL-11R:LIFR exprimieren, was den Umfang potenzieller Zielzellen im Körper einschränkt, wohingegen HIL-6 auf fast alle Zellen abzielt. denn im Gegensatz zu IL-11R und LIFR gilt gp130 als allgegenwärtig exprimiert71. Da jedoch IL-11R, LIFR sowie gp130 auf Hepatozyten exprimiert werden, konnte GIL-11 die IL-6-Transsignalisierung kompensieren und IL-6R-/-Mäuse vor dem Tod nach PHX retten. Interessanterweise veränderten sich die meisten Parameter, einschließlich Körper-, Leber- und Milzgewicht, bei überlebenden, mit GIL-11 behandelten und unbehandelten Mäusen nicht. GIL-11 erhöht jedoch SAA1 selbst neun Tage nach PHX um mehr als das 300-fache. SAA1 induziert die Proliferation hepatischer Sternzellen72, was nach der Anwendung von GIL-11 zur Leberregeneration beitragen könnte.
Nachdem wir die allgemeine In-vitro- und In-vivo-Aktivität gezeigt haben, glauben wir, dass GIL-11 für Erkrankungen von allgemeinem Interesse sein wird, bei denen Zytokine vom IL-6-Typ, einschließlich IC7, positive Wirkungen zeigen73. Kürzlich wurden die ursprünglich beschriebenen positiven Wirkungen von menschlichem IL-116 in Mausmodellen menschlicher Krankheiten in Frage gestellt. Es wurde festgestellt, dass die Wirkungsweise von in Mäuse injiziertem menschlichem IL-11 tatsächlich auf der kompetitiven Hemmung der endogenen IL-11-Signalübertragung beruht26. Es wurde der Schluss gezogen, dass IL-11 bei einer Vielzahl muriner Krankheitsmodelle, einschließlich nichtalkoholischer Steatohepatitis, kardiovaskulärer Fibrose, idiopathischer Lungenfibrose und fibrotischer Lungenerkrankung, eher schädliche als positive Auswirkungen hat26. Interessanterweise wurde angenommen, dass IL-11 bevorzugt die ERK-Signalisierung induziert und nicht wie IL-6, das über dasselbe gp130-Homodimer, die STAT3-Phosphorylierung, wirkt26. Daher behandelten wir murinen Myoblasten (C2C12-Zellen) mit rekombinantem HIL-11, IL-11 und GIL-11 in Gegenwart und Abwesenheit von murinem IL-11R, was jedoch zu einer anhaltenden IL-11R-abhängigen STAT3-Phosphorylierung führte. Die Injektion von GIL-11 in Mäuse führte auch zu einer anhaltenden STAT3-Phosphorylierung im Herz-, Leber- und Milzgewebe, was zeigt, dass unsere menschlichen Zytokine und GIL-11 die kanonischen Signalwege gp130 und gp130:LIFR aktivieren, die durch STAT3-Phosphorylierung gekennzeichnet sind. Aus unbekannten Gründen und im Gegensatz zu IL-11 induziert GIL-11 die Transsignalisierung über GIL-11:sIL-11R-Komplexe nur schwach und wird durch sgp130Fc nicht gehemmt. Es wird interessant sein zu sehen, welche Konsequenzen die Anwendung von GIL-11 für Mausmodelle fibrotischer Erkrankungen haben wird.
Obwohl LIF mit der Fruchtbarkeit und einer Reihe neurologischer Störungen, einschließlich Multipler Sklerose, zusammenhängt, wird rekombinantes LIF nicht als Therapie eingesetzt74,75. Die Fähigkeit von GIL-11, LIF-ähnliche Signale über gp130:LIFR-Komplexe zu induzieren, könnte LIF-ähnliche Anwendungen als potenziellen Ersatz für rekombinantes hLIF eröffnen. Da für die GIL-11-Aktivität Zellen erforderlich sind, die nicht nur LIFR, sondern auch IL-11R exprimieren, ist die Aktivität von GIL-11 im Vergleich zu LIF auf eine geringere begrenzte Anzahl von Zielzellen beschränkt, was potenziell unerwünschte negative Nebenwirkungen lindern könnte.
Zusammenfassend definiert unsere Studie GIL-11 nach unserem besten Wissen als ein neuartiges vielversprechendes Zytokimer mit spezifischer hochaffiner Aktivierung des nicht-natürlichen Rezeptorkomplexes gp130:LIFR:IL-11R. Die modulare Architektur von Zytokimeren ermöglicht im Allgemeinen eine breite Palette gezielter Rezeptorkombinationen und gezieltes Zell-Targeting.
Die für GIL-11 kodierende cDNA wurde von der BioCat GmbH bestellt, war codonoptimiert und basierte auf humanem IL-11 und LIF. Die GIL-11-cDNA wurde dann in den pcDNA3.1-Expressionsvektor einschließlich des 5'-Signalpeptids für menschliches IL-11R (Q14626, aa 1–24) eingefügt, gefolgt von Sequenzen für den myc-Tag (EQKLISEEDL) und dem für GIL-11 kodierenden Fragment. Gly4Ser-Linker, eine TEV-Erkennungsstelle und ein Twin-Strep-Tag.
Proteinmodelle wurden über das Phyre2-Webportal76 erstellt. Komplexe Modelle und strukturbasierte Sequenzausrichtungen wurden mit UCSF Chimera Version 1.13.1 generiert, entwickelt von der Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics an der University of California, San Francisco, mit Unterstützung von NIH P41-GM10331177.
Die Erzeugung von Ba/F3-gp130-, Ba/F3-gp130:IL-6R- und Ba/F3-gp130:IL-11R-Zellen wurde an anderer Stelle beschrieben35,36. Die Verpackungszelllinie Phoenix-Eco wurde von Ursula Klingmüller (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) erhalten. NIH/3T3-Zellen wurden vom Leibnitz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur (Braunschweig, Deutschland) erworben. Alle Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 in einer wassergesättigten Atmosphäre in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), einem Kulturmedium mit hohem Glucosegehalt (GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland) und 10 % fötalem Kälberserum (GIBCO) gezüchtet ®, Life Technologies) und 60 mg/l Penicillin und 100 mg/l Streptomycin (Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm, Deutschland). Murine Ba/F3-gp130-Zellen wurden von Immunex (Seattle, WA, USA) erhalten und in Gegenwart von HIL-6 gezüchtet. 0,2 % (10 ng/ml) konditioniertes Medium aus einem stabilen Klon von CHO-K1-Zellen, die HIL-6 im Überstand sezernieren78. Expi-293F™-Zellen (ThermoFisher Scientific) wurden in Expi293™-Expressionsmedium ohne Antibiotika kultiviert, bis sie in einem Inkubator bei 37 °C mit 8 % CO2 auf einem Orbitalschüttler bei 125 U/min eine Dichte von 3–5 × 106 c/ml erreichten. Synthetische Liganden wurden wie beschrieben exprimiert und gereinigt79. Rekombinantes menschliches OSM (Katalog-Nr. 295-OM) und rekombinantes menschliches LIF (Katalog-Nr. 7734-LF) wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) erworben. Für die Expression von IL-11 wurde ein Expressionsplasmid für IL-11 pET22-IL-11-His6 verwendet. IL-11 wurde als lösliches Protein in Escherichia coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie mit immobilisierten Metallen gereinigt. Sgp130FC wurde in ExpiCHOTM-Zellen (ThermoFisher Scientific) exprimiert. Die Zellen wurden in ExpiCHOTM-Medium kultiviert und gemäß Herstellerhandbuch (Katalognummer: A29133) transfiziert. Das Protein wurde wie zuvor beschrieben80 gereinigt.
Ba/F3-gp130-Zelllinien wurden dreimal mit PBS gewaschen, um Zytokine zu entfernen, und 3 Stunden lang in serumfreiem DMEM ausgehungert. Der Inhibitor sgp130Fc oder sIL-11R wurde 5 Minuten vor der Stimulation hinzugefügt. Die Zellen wurden 15 Minuten lang (oder wie angegeben) mit gereinigtem Protein (Konzentration wie angegeben) stimuliert, geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann lysiert. Im Fall der C2C12- und NIH/3T3-Zellen wurden die Zellen nach der Stimulation einmal mit PBS gewaschen, bevor sie durch eine 5-minütige Behandlung mit 0,05 % Trypsin, 0,1 % EDTA (Genaxxon, Katalog: C4261.0100) abgelöst und erneut gewaschen wurden. Die Zellen wurden 45 Minuten lang mit Puffer lysiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2 und eine vollständige EDTA-freie Proteaseinhibitormischungstablette (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) enthielt. Die Proteinkonzentration wurde durch einen BCA-Proteintest (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Proteinexpression und Signalwegaktivierung wurde dann durch Western Blot analysiert.
Fünfzig Mikrogramm Gesamtprotein wurden in jede Spur geladen und durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran (Amersham Protan; Cytiva; LC, UK; Katalog-Nr. 10600016) übertragen. Die Blockierung der Membran erfolgte mit Blockierungspuffer (Intercept® Blocking Buffer; LI-COR; USA; Katalog-Nr. 927-60001), 1:3 verdünnt in TBS (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl) für 1 Stunde. Primärantikörper (Phospho-STAT3; Tyr-705; D3A7; Katalog-Nr. 9145, STAT3; 124H6; Katalog-Nr. 9139, Erk1/2; L34F12; Katalog-Nr. 4696, Phospho-Erk1/2; D13.14.4E; Katalog Nr. 4370, Cell Signaling Technology, USA, wurden 1:1000 in Blockierungspuffer mit 0,2 % Tween-20 (Sigma-Aldrich; USA; Katalog-Nr. P1379-1L) für mindestens 90 Minuten bei Umgebungstemperatur oder über Nacht bei 4 °C verdünnt C. Die Membranen wurden mit TBS-T (0,1 % Tween-20) gewaschen und dann mit sekundären Fluorophor-konjugierten Antikörpern 1:10.000 inkubiert (IRDye® 800CW Donkey anti-Rabbit; Katalog-Nr. 926-32213 und IRDye® 680RD Donkey anti-Rabbit). Maus; Katalog-Nr. 926-68072, LI-COR; USA) für 1 Stunde. Die Signalerkennung wurde mit LI-COR Odyssey; USA; Modell 2800 erreicht. Sekundärantikörper wurden gleichzeitig auf verschiedenen Kanälen nachgewiesen. Die Datenanalyse wurde mit Image Studio Lite 5.2 durchgeführt. Leber-, Milz- und Herzgewebe wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 2 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 % NP-40, 1 % Triton X-100) lysiert , 1 cOmplete Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette). Nach der Lyse wurde der Proteingehalt mittels BCA-Assay gemessen. Anschließend wurde jede Zeile mit einer Gesamtproteinmenge von 50 Mikrogramm beladen, gefolgt von einem Immunblotting. Folgende Antikörper wurden für das Blotting lysierter Tierorgane verwendet: Anti-p-STAT3 (Katalog-Nr. 9145), Anti-Total-STAT3 (Katalog-Nr. 9139).
Ba/F3-gp130-Zelllinien wurden dreimal mit PBS gewaschen, um Zytokine aus dem Medium zu entfernen. Zellen mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen/ml wurden in DMEM suspendiert, das 10 % fötales Kälberserum, 60 mg/l Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin enthielt. Die Zellen wurden 3 Tage lang in einem Volumen von 100 µl mit oder ohne Zytokine oder Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen kultiviert. Der CellTiter Blue Viability Assay (Promega, Karlsruhe, Deutschland) wurde verwendet, um die ungefähre Anzahl lebensfähiger Zellen durch Messung der Fluoreszenz (λex560 nm/λem590 nm) mit dem Plattenlesegerät Infinite M200 Pro (Tecan, Crailsheim, Deutschland) zu bestimmen. Nach Zugabe von 20 µl/Well CellTiter Blue-Reagenz (Zeitpunkt 0) wurde die Fluoreszenz nach 60 Minuten alle 20 Minuten bis zu 2 Stunden lang gemessen. Für jede Versuchsbedingung wurden 3 Vertiefungen gemessen. Alle Werte wurden normalisiert, indem die Werte zum Zeitpunkt 0 von der endgültigen Messung abgezogen wurden.
Ba/F3-gp130-Zelllinien wurden wie beschrieben retroviral mit den pMOWS-Expressionsplasmiden transduziert34. Transduzierte Zellen wurden in DMEM-Medium wie oben beschrieben, ergänzt mit 10 ng/ml HIL-6, gezüchtet. Die Selektion transduzierter Ba/F3-gp130-Zellen wurde mit Puromycin (1,5 μg/ml) oder Hygromycin B (1 mg/ml) (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) für mindestens 2 Wochen durchgeführt. Anschließend wurden die erzeugten Ba/F3-gp130-Zelllinien mittels Durchflusszytometrie auf die Expression der Rezeptorzelloberfläche analysiert. C2C12-Zellen wurden mit 7,5 µg pcDNA3.1-Plamid, das für mIL-11R-cDNA kodiert, und 15 µl TurboFect transfiziert und 48 Stunden lang inkubiert.
Die Zelloberflächenexpression stabil transfizierter Ba/F3-gp130-Zelllinien wurde durch spezifische Antikörper nachgewiesen. 5 × 105 Zellen wurden in FACS-Puffer (PBS, 1 % BSA) gewaschen und dann in 50 µl FACS-Puffer inkubiert, der den angegebenen spezifischen Primärantikörper enthielt (Anti-LIFR oder –OSMR; 1:20; Katalog-Nr. BAF249 und BAF4389, R&D Systems; MN, USA). Nach einer Inkubation von mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Zellen gewaschen und in 50 µl FACS-Puffer, der sekundären Antikörper (NothernLights 493-konjugiertes Anti-Ziegen-IgG 1:200) enthielt, resuspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in 500 µl FACS-Puffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert (BD FACSCanto II-Durchflusszytometer unter Verwendung der FACSDiva-Software, BD Biosciences). Die Datenanalyse wurde mit FlowJo Version 10 (Tree Star Inc, USA) durchgeführt.
C57BL/6- und IL-6R−/−-Mäuse52 wurden vom Jackson Laboratory bzw. der Tierklinik der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf bezogen. Die Experimente dieser Studie wurden gemäß den Anforderungen des LANUV-NRW, Deutschland mit der Zulassungsnummer 84-02.04.2019.A303 durchgeführt.
Ba/F3-gp130-IL-11R:LIFR-Zellen wurden mit GIL-11, IL-11 oder LIF 40 Minuten lang bei 37 °C stimuliert. mRNA wurde mit NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland; Kat.-Nr. 740955.250) gemäß Herstellerhandbuch isoliert. DNase-verdaute Gesamt-RNA-Proben, die für 3′-RNA-Seq-Analysen verwendet wurden, wurden quantifiziert (Qubit RNA HS Assay, Thermo Fisher Scientific) und die Qualität durch Kapillarelektrophorese mit dem Fragment Analyzer und dem „Total RNA Standard Sensitivity Assay“ (Agilent Technologies, Inc.) gemessen . Santa Clara, USA). Alle Proben in dieser Studie zeigten sehr hochwertige RNA-Qualitätszahlen (RQN; Mittelwert = 10,0). Die Bibliotheksvorbereitung wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung des QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD von Lexogen® durchgeführt. Der Input-Mount betrug 200 ng Gesamt-RNA. Perlengereinigte Bibliotheken wurden normalisiert und schließlich auf dem NextSeq2000-System (Illumina Inc. San Diego, USA) mit einem Lese-Setup von SR 1 × 100 bp sequenziert. Das Illumina DRAGEN FASTQ Generation Tool (Version 3.8.4) wurde zum Konvertieren der BCL-Dateien in FastQ-Dateien sowie zum Adapter-Trimmen und Demultiplexen verwendet. Die Genontologieanalyse wurde mit dem R-Paket Clusterprofiler und R-Version 4.1.3 durchgeführt.
Alle Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und gemäß den von FELASA und der nationalen Tierschutzbehörde GV-SOLAS (www.gv-solas.de) festgelegten Vorschriften behandelt. Alle transgenen Tiere befanden sich auf einem C57BL/6 N-Hintergrund. Die Mäuse wurden mit einer Standard-Labordiät gefüttert und erhielten nach Belieben autoklaviertes Leitungswasser. Sie wurden in einem klimatisierten Raum mit kontrollierter Temperatur (20–24 °C), Luftfeuchtigkeit (45–65 %) und Tag-/Nachtzyklus (12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit) gehalten. Die Laparotomie wurde überwiegend an männlichen Mäusen im Alter von mindestens 10–12 Wochen unter Verwendung von Isofluran-Inhalationsnarkose, 1,5–2 % Isofluran mit 1 l/min Sauerstoff, durchgeführt81. Um eine 70 %ige partielle Hepatektomie durchzuführen, wurden der rechte Oberlappen, der linke Oberlappen und der linke Unterlappen der Leber zusammen mit der Gallenblase durch eine einstufige Ligatur unter Verwendung eines 5-0-Polyester-Nahtbandes (B. Braun Surgical, SA, Rubi) reseziert , Spanien). Danach wurden die Bauchhöhle und die äußere Hautschicht mit 5-0 Polyglykolsäure (HR13, B. Braun Surgical, SA, Rubi, Spanien) und 4-0 Polypropylen-Monofilament (DS16, B. Braun Surgical, SA, Rubi, Spanien) verschlossen. Spanien) bzw. Um die leichten Schmerzen bei der Operation zu lindern, wurden Mäuse nach der Operation mit 5 mg/kg Carprofen (Rimadyl; Pfizer, Würselen, Deutschland) behandelt. IL-6R-/-Mäuse wurden zu 70 % einer partiellen Hepatektomie unterzogen. Zu bestimmten Zeitpunkten (0, 12 und 24 Stunden) nach der Operation wurden die Mäuse gewogen und anästhesiert (100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin; Vetoquinol GmbH, Ravensburg, Deutschland). Nach der Anästhesie wurde den Mäusen Blut entnommen, um das Serum für die weitere Analyse zu gewinnen. Für das Lebergewebe wurde die Leber mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und gewogen, um das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht zu berechnen. Die Gewebeproben wurden zur Histologie sowie zur RNA- und Proteinextraktion bei –80 ° C gelagert.
GIL-11 wurde von Expi293-Zellen (Thermo Fisher) produziert und sezerniert und durch Strep-Tag-Affinitätschromatographie (Strep-TactinXT 4flow; IBA, Katalog-Nr. 2-5023-001) gemäß dem Handbuch des Herstellers gereinigt. Um die Zytokinsignalisierung zu forcieren, wurden Mäusen 24 Stunden vor und direkt nach der Operation intraperitoneal (ip) 20 µg GIL-11 injiziert.
Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) aus Leber und Milz extrahiert. Die RNA-Konzentration wurde mit dem NanoDrop 2000c-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA, Kat.-Nr. 172-5140) gemessen und für alle Proben auf 100 ng/µl eingestellt. Um die Expression spezifischer Gene zu bestimmen, wurde das iTaqTM Universal SYBR green One-Step Kit (BioRad, Kalifornien, USA, Katalog-Nr. 1725151) verwendet. Master Mix wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Es wurden 5 µl iTaq-Universalsonden-Reaktionsmix (2×), 0,125 µl iScript Advanced Reverse Transkriptase, 0,125 µl Primer und 200 ng RNA verwendet. Das Gesamtvolumen der Mischung wurde dann durch Zugabe von nukleasefreiem H2O auf 10 µl eingestellt. Zur Analyse wurden die Expressionsniveaus aller Zielgene auf die Expression der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (gapdh) (ΔCT) normalisiert. Die Genexpressionswerte wurden basierend auf der ΔΔCt-Methode berechnet. Relative Größen82 wurden mit der Gleichung RQ = 2−ΔΔCt ermittelt. Das Expressionsniveau der Zielgene wurde mit dem Echtzeit-PCR-System ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestimmt. Die folgenden Primerpaare wurden in dieser Studie verwendet: GAPDH fw 5' TCCCACTCTTCCACCTTCGA, GAPDH rev 5' AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT, SAA1 fw 5' GACACCATTGCTGAGCAGGAA, SAA1 fw 5' GGGAGTCCAGGAGCTCTGTAG, Ki67 fw 5' GCCGAGTCTGGCATTGAA, Ki67 rev 5' TTTTCTTTCTTCTTT TGCTGAGG, EGF fw 5′ TTCTCACAAGGAAAGAGCATCTC, EGF rev 5′ GTCCTGTCCCGTTAAGGAAAAC, Cyclin A2 fw 5′ GAGGTGGGAGAAGAATATAA, Cyclin A2 rev 5′ ACTAGGTGCTCCATTCTCAG, G0S2 vw 5′ TCTCTTCCCACTGCACCCTA, G0S2 rev 5′ TCCTGCACACTTTCCATCTG, aSMA fw 5′ CTGACA GAGGCACCACTGAA, ASMA rev 5′ CATCTCCAGAGTCCAGCACA.
Die Daten werden als arithmetisches Mittel ± SEM unter Verwendung von GraphPad Prism, Version 8, bereitgestellt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit einem Students-T-Test ermittelt, einschließlich der Welch-Korrektur, falls angegeben. Die statistische Analyse zwischen mehreren Gruppen erfolgte mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA, einschließlich Tukey- oder Dunnet-Korrektur. Die Signifikanz wurde wie folgt berechnet: p > 0,05: ns; p < 0,05: *; p < 0,01: **; p < 0,001: ***; p < 0,0001: ****. In-vitro-Tests wurden mindestens in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Für In-vivo-Experimente wurden Wurfgeschwistermäuse als unabhängige Einzelproben verwendet.
Datenanalysen an Fastq-Dateien wurden mit CLC Genomics Workbench (Version 22.0.2, QIAGEN, Venlo, NL) durchgeführt. Nach der UMI-Filterung (Unique Molecular Identifier) wurden alle verbleibenden Lesevorgänge aller Sonden durch den Adapter und die Qualität gekürzt (unter Verwendung der Standardparameter: Basen unter Q13 wurden vom Ende der Lesevorgänge an gekürzt, mehrdeutige Nukleotide maximal 2). Die Kartierung erfolgte anhand der Genomsequenz von Mus musculus (mm39; GRCm39.107) (20. Juli 2022). Nach der Gruppierung der Proben (jeweils für biologische Replikate) entsprechend ihrer jeweiligen experimentellen Bedingungen wurde die statistische Differenzexpression mit dem Tool „Differential Expression for RNA-Seq“ (Version 2.7) bestimmt. Die resultierenden P-Werte wurden für mehrere Tests durch FDR-Korrektur korrigiert. Ein AP-Wert von ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. Der Gene Set Enrichment Test (Version 1.2) wurde mit Standardparametern durchgeführt und basierte auf dem GO-Begriff „biologischer Prozess“ (M. musculus; 16. Dezember 2021). Für jede Gruppe wurden n = 4 biologisch unabhängige Proben verwendet.
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.
Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Manuskript und auf Anfrage bei den Autoren erhältlich sind. Genexpressionsdaten von 3′-RNA-Seq sind unter NCBI Gene Expression Omnibus verfügbar; Zugangscode: GSE226064. Das für GIL-11 kodierende Plasmid wurde bei Addgene hinterlegt; Plasmid-ID: 199627 und wird auf Anfrage zur Verfügung gestellt.
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Puyan Rafii, Christiane Seibel, Hendrik T. Weitz, Julia Ettich, Anna Rita Minafra, Doreen M. Floss, Kristina Behnke, Jens M. Moll & Jürgen Scheller
Biologisches und Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ), Medizinische Fakultät, Heinrich-Heine-Universität, Universitätsstraße 1, 40225, Düsseldorf, Deutschland
Patrick Petzsch
Kardiovaskuläres Forschungslabor, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Düsseldorf, 40225, Düsseldorf, Deutschland
Alexander Lang & Karl Köhrer
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PR führte die meisten Experimente durch, Datenkuration, PR, CS, AM, HTW, DMF, KB, JM, JS formale Analyse, Validierung, Untersuchung, Methodik, Manuskriptkorrektur; KB und HTW führten eine teilweise Hepatektomie durch. JE unterstützte das Klonen und die Zellkultur. CS exprimierte und reinigte das sgp130Fc; PP und KK halfen bei der transkriptomischen Analyse; AL half beim Venn-Diagramm und der Genontologie; PR- und JS-Schreiben – Originalentwurf; JS-Projektverwaltung, Fördermittelakquise.
Correspondence to Jürgen Scheller.
JS, PR und JM sind Erfinder von GIL-11 und halten Patente für dieses Molekül (EP22214005.5). Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
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Rafii, P., Seibel, C., Weitz, HT et al. Cytokimera GIL-11 rettete Mäuse mit IL-6R-Mangel vor dem durch eine partielle Hepatektomie verursachten Tod durch Signalübertragung über nicht-natürliche gp130:LIFR:IL-11R-Komplexe. Commun Biol 6, 418 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4
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Eingegangen: 30. Juni 2022
Angenommen: 27. März 2023
Veröffentlicht: 15. April 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4
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