Eine Methode zur parallelen Proteinmarkierung im Mikromaßstab und zur präzisen Kontrolle des durchschnittlichen Markierungsgrads (aDoL)

Mar 22, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8961 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein weit verbreiteter Ansatz zur Proteinkonjugation besteht darin, die Lysinreste mit NHS- oder anderen aktiven Estern zu reagieren. Aufgrund der Instabilität des aktiven Esters und der Variabilität der Reaktionseffizienzen ist es jedoch eine Herausforderung, den Grad der Markierung (DoL) genau zu steuern. Hier stellen wir ein Protokoll zur besseren Kontrolle von aDoL unter Verwendung bestehender kupferfreier Click-Chemie-Reagenzien bereit. Es handelt sich um eine zweistufige Reaktion mit einer dazwischen liegenden Reinigung. Kurz gesagt, die interessierenden Proteine ​​wurden zunächst mit Azid-NHS aktiviert. Nach der Entfernung von nicht umgesetztem Azid-NHS wird das Protein-N3 dann mit einer begrenzten Menge an komplementärem Click-Tag umgesetzt. Unsere Studien haben gezeigt, dass das Click-Tag nach 24-stündiger Inkubation vollständig mit dem Protein-N3 reagiert und daher keine zusätzlichen Reinigungsschritte erfordert. Somit entspricht die aDoL dem eingegebenen Molverhältnis des Click-Tags und des Proteins. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz eine viel einfachere und wirtschaftlichere Möglichkeit, eine parallele Etikettierung im Mikromaßstab durchzuführen. Sobald ein Protein mit N3-NHS voraktiviert ist, kann jedes Fluorophor oder Molekül mit dem komplementären Klick-Tag durch Mischen der beiden Bestandteile an das Protein gebunden werden. Die Menge des in der Klick-Reaktion eingesetzten Proteins kann beliebig sein. In einem Beispiel haben wir einen Antikörper parallel mit 9 verschiedenen Fluorophoren markiert, wobei wir insgesamt 0,5 mg Antikörper verwendeten. In einem anderen Beispiel haben wir Ab mit einem angestrebten aDoL-Wert von 2 bis 8 markiert. In einer Stabilitätsvergleichsstudie haben wir herausgefunden, dass das konjugierte Fluorophor mit dem vorgeschlagenen Klickprotokoll länger am Protein gebunden blieb als mit der Standard-NHS-Fluorophor-Markierung.

Proteine ​​spielen eine zentrale Rolle in der Biologie und es ist für Forscher von entscheidender Bedeutung, sie sichtbar oder nachweisbar zu machen, um ihre Funktionen und Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Jahr 2001 veröffentlichte Sharpless eine bahnbrechende Arbeit, in der eine einfache Strategie beschrieben wurde, zwei Moleküle durch „Klicken“ miteinander zu verbinden1. Später entwickelten Meldal und Bertozzi die Chemie weiter und machten sie einer breiten Anwendung zugänglich2,3, wofür ihre Arbeiten 20 Jahre später anerkannt und mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurden. Die bioorthogonale Chemie oder Klick-Chemie hat große Vorteile für die hochspezifische gezielte Ansprache modifizierter einzelner Proteine ​​mit Sonden oder Tags in komplexen Systemen gezeigt4,5,6,7,8,9,10. Es gab auch andere bedeutende Fortschritte bei chemo- und regioselektiven Markierungsmethoden, um eine einzelne Markierung zu erreichen, die an native Proteine ​​gebunden ist11,12. Ausführliche Rezensionen und Bücher zur Proteinbiokonjugation finden Sie unter 13,14,15. Erwähnenswert ist auch, dass der Cysteinrest ein weiteres beliebtes Ziel für die ortsspezifische Proteinkonjugation ist. Die meisten Proteine ​​enthalten keine nativen freien Thiole, die gezielt angegriffen werden können, und die Reduzierung von Disulfidbindungen kann schädliche Auswirkungen auf die Struktur haben. Daher ist die Einführung eines einzelnen Cysteinrests über Punktmutation ein bevorzugter Ansatz, um eine einzelne Markierung an einer genauen Proteinstelle zu befestigen . Unabhängig von den oben genannten Ansätzen bleiben der klassische N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester und andere aktive Ester die bevorzugte funktionelle Gruppe, um Fluorophor, Chromophor, Biotin und DNA über einen Lysinrest an ein Protein zu binden16,17. Die Fülle an Lysinresten in den meisten Proteinen erleichtert die Markierung und ist eine einstufige Reaktion plus einstufige Reinigung. Aufgrund der Instabilität (Hydrolyse) des aktiven Esters, der Inkonsistenz der Reaktionseffizienz und der Bedenken, dass eine Übermarkierung die Funktion des Proteins beeinträchtigen könnte18, bleibt dies jedoch eine entmutigende Aufgabe.

Hier beschreiben wir eine Markierungsmethode, die eine gezielte aDoL mithilfe leicht verfügbarer kupferfreier Click-Chemie-Reagenzien garantiert. Die Bindungsstellen sind stochastisch auf die Lysinreste auf der Proteinoberfläche ausgerichtet, und der aDoL ist die durchschnittliche Anzahl der an jedes Protein konjugierten Tags (Fluorophore). Es handelt sich um eine zweistufige Reaktion mit einem Reinigungsschritt dazwischen (dargestellt in Abb. 1). Im ersten Schritt wurde das Protein mit N3-NHS aktiviert und überschüssiges N3-NHS nach der Reaktion entfernt. Im zweiten Schritt wurde das Protein-N3 mit Fluorophor-DBCO in einem Molverhältnis gemischt, das dem gewünschten aDoL entsprach. Nach einer 24-stündigen Inkubation ist das markierte Protein gebrauchsfertig.

Schema zur Klickkennzeichnung mit gezieltem aDoL. Die Zahl in Klammern gibt das Molverhältnis in der Reaktion an. Die Verwendung eines 15-fachen molaren Überschusses an N3-NHS ergibt normalerweise etwa 5 N3- pro Protein, vorausgesetzt, das Protein verfügt über genügend Lysinreste. Der durchschnittliche Markierungsgrad (aDoL) kann mit dem molaren Verhältnis der Reagenzien im zweiten Reaktionsschritt gesteuert werden. Der Tag kann DBCO oder andere zu N3- komplementäre Cyclooctine sein.

Der Erfolg des vorgeschlagenen Markierungsprotokolls hängt von zwei Bedingungen ab: (1) Im Aktivierungsschritt sollte die durchschnittliche Anzahl an an das Protein gebundenem N3 höher sein als der gewünschte aDoL, (2) das hinzugefügte Fluorophor-DBCO muss vollständig verbraucht werden im zweiten Schritt und macht so eine zusätzliche Reinigung überflüssig. Das Protokoll wurde an zwei Proteinsystemen getestet, einem kleinen Protein: Apomyoglobin (apoMb, 17 kDa) und einem Antikörper (150 kDa). Sie wurden beide mit AZ488-DBCO markiert und erreichten einen aDoL von 2–4 für ApoMb und einen aDoL von 2–8 für Antikörper. Chromatographie und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wurden verwendet, um die Markierungsreaktion zu überwachen, nicht umgesetzte Fluorophore zu erkennen und die Helligkeit der Konjugate zu charakterisieren.

FCS misst die Signalfluktuation fluoreszierender Moleküle, wenn diese frei durch ein genau definiertes Beleuchtungsvolumen (~ 1 fL) diffundieren. Diese elegante Technik wurde vor mehr als 30 Jahren eingeführt19, wurde jedoch erst Mitte der 90er Jahre häufig eingesetzt, als schnellere Computer und fortschrittlichere Instrumente verfügbar wurden. Einen umfassenden Überblick über die FCS-Grundprinzipien und -Anwendungen finden Sie an anderer Stelle20. Die berechnete Autokorrelationskurve gibt Aufschluss über die Diffusionsgeschwindigkeit der fluoreszierenden Moleküle. Ein kleineres Molekül (z. B. ein freies Fluorophor) weist im Vergleich zu einem fluoreszierend markierten Protein eine schnellere Diffusionsrate auf und spiegelt sich daher in einer nach rechts verschobenen Autokorrelationskurve während der Markierungsreaktion wider.

Azidoessigsäure-NHS-Ester (N3-NHS) und alle Fluorophor-DBCO wurden von Click Chemistry Tool (Scottsdale, AZ) gekauft. AlexaFluor 488-SDP (AF488-SDP) und Zeba Spin-Entsalzungssäulen wurden von Thermo-Fisher Scientific (Waltham, WA) erworben. Cy5-NHS wurden von GE Healthcare (Buckinghamshire, UK) gekauft. NGAL, Anti-NGAL-Antikörper und Anti-Biotin-Antikörper, die in der Studie verwendet wurden, wurden intern vom Abbott-Labor21 (Abbott Park, IL) hergestellt. Apomyoglobin wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO.) gekauft. Ziegen-Anti-Maus-Antikörper – Dylight 649 wurde von Jackson ImmunoResearch Inc (Westgrove, PA) gekauft. Chromlink Biotin wurde von Vector Laboratories (Newark, CA) gekauft.

Der Anti-NGAL-Ab1 in einer Konzentration von 2 mg/ml in PBS-Puffer wurde mit einem achtfachen molaren Überschuss an AF488-SDP-Ester gemischt. Die Reaktion wurde über Nacht bei 2–8 °C durchgeführt. Überschüssiges AF488-SDP wurde entfernt, indem die Probe zweimal durch Zeba-Spin-Entsalzungssäulen geleitet wurde.

1–2 mg N3-NHS wurden in DMSO auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Konzentration von N3-NHS wurde durch genaues Wiegen oder Messen des hydrolysierten Produkts NHS bestimmt, ε260 nm = 9700/M/cm22. Beide Methoden wurden zur Bestimmung der Konzentration von N3-NHS verwendet. Die Unterschiede lagen innerhalb von 5 %. Im Voraktivierungsschritt wurde ein breiter molarer Überschuss an N3-NHS (vier- bis fünffacher Überschuss) mit 2 mg/ml Antikörper oder 1,2 mg/ml Apomyoglobin gemischt, um nach einer zweistündigen Inkubation bei Raum verschiedene IR zu erreichen Temperatur wurde das nicht umgesetzte N3-NHS entfernt, indem die Proben zweimal durch Zeba-Spin-Entsalzungssäulen geleitet wurden. Die Bindung einer Azidogruppe an das Protein hat keinen Einfluss auf das Absorptionsspektrum des Proteins, daher wird die Konzentration von Ab-N3 oder apoMb-N3 mit dem Extinktionskoeffizienten von Ab oder apoMb bestimmt (Ab: ε280 = 217.500/M/cm, apoMb : ε280 = 15.900/M/cm).

Wir haben zwei Methoden angewendet, um das Einbauverhältnis (IR) von N3- zu Protein zu bestimmen. Das Ab-N3 reagierte zunächst mit einem molaren Überschuss an Cy5-DBCO (jeder N3-Tag sollte mit einem Cy5-DBCO versehen sein), die Probe wurde zur Analyse nach 24-stündiger Inkubation in eine analytische HPLC injiziert, das Absorptionsspektrum bei 8,8 Minuten wurde zur Bestimmung verwendet die IR Die folgende Gleichung wurde verwendet, um aDoL von Cy5 zu Ab zu berechnen ([Cy5] = A663/255.000/M/cm; [Ab] = (A280 − 0,05 × A663)/217.500/M/cm; aDoL = [Cy5] /[Ab]), was eine gute Schätzung der IR von Ab-N3 wäre. Die markierten ApoMbs wurden mit einem TripleTOF® 5600-Massenspektrometer (Sciex, Framingham, MA) analysiert, gekoppelt mit einem Eksigent MicroLC 200 HPLC (Sciex, Framingham, MA). Die Verteilung mehrerer Ladungszustände der Proteinproben wurde mithilfe der Rekonstruktionsfunktion entfaltet, die in der Peakview-Software von AB Sciex verfügbar ist. Die durchschnittliche IR wird nach folgender Formel berechnet: ∑(Anzahl des an Protein gebundenen N3 x Peakintensität)/∑(Peakintensität).

Alle Fluorophor-DBCO-Vorräte wurden in DMSO auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml gelöst und dann in PBS-Puffer auf ~ 100 μM verdünnt. Die 2 mg/ml Ab-N3 (IR 7) wurden in kleine Aliquots (50 μl) aufgeteilt und jeweils mit dem 2-fachen Moläquivalent von AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO umgesetzt. AZ594-DBCO oder Cy5-DBCO. Die Produkte wurden mittels HPLC analysiert, um die Reaktionseffizienz zu bestimmen.

Die Reaktionskinetik von Protein-N3 und AZ488-DBCO wurde durch analytische Chromatographie unter Verwendung der Agilent Chemstation überwacht. 50 μl der Mischung wurden zu verschiedenen Zeitpunkten (5 Min.–24 h) auf die analytische SRT-C SEC 300 (HPLC-Säule, Sepax) injiziert. Änderungen im Elutionsprofil spiegeln den Fortschritt der Reaktion wider. In dem Experiment, bei dem 2 mg/ml Ab-N3 mit neun verschiedenen Fluorophor-DBCOs umgesetzt wurden, wurden die Reaktionsmischungen nach einer Inkubation von 24 ± 1,5 Stunden auf dieselbe Säule injiziert. Zwischen der ersten und der letzten Probeninjektion gab es einen Unterschied von 3 Stunden. Der Detektor wurde auf das Absorptionsmaximum des entsprechenden Fluorophors eingestellt. Die Elutionsprofile wurden zum Nachweis von nicht umgesetztem Fluorophor-DBCO verwendet.

FCS-Experimente wurden mit einem Fluoreszenzkorrelationsspektrometer (ALBA, ISS, Champaign, IL) durchgeführt, das mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse TE300 (Nikon InsTech Co., Ltd., Kanagawa, Japan) und einem Mai Tai Ti-Saphir-Laser von Spectra-Physics integriert war23 . Das System wird vor jedem Gebrauch mit analytisch vorbereitetem 20 nM AlexaFluor 488 kalibriert. Alle Proben wurden in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA und 0,005 % Tensid P20) auf 50–100 nM verdünnt und zur FCS-Messung in eine Glasbodenplatte mit 384 Vertiefungen geladen.

Die in der Studie verwendeten Antikörper sind Anti-NGAL-Antikörper und Anti-Biotin-Antikörper. Zum Vergleich der Bindungsaktivität des Antikörpers wurden zwei unabhängige Protokolle verwendet. In einem Ansatz wurden serielle Titrationen mit Anti-NGAL-Ab 1 mit drei verschiedenen IRs (IR 7, 15 und 24) und unmarkiertem Ab 1 durchgeführt. Die Abs wurden in 10 mM HEPES-Puffer auf 100 pM verdünnt. Jeder Ab wurde mit einer Reihe von 2x verdünnter NGAL-Cy5-Lösung titriert. Nach der Inkubation über Nacht wurde der Antikörper oder der Antikörper-NGAL-Cy5-Komplex von mit Sekundärantikörpern (Ziege-Anti-Maus-IgG-Ab) beschichteten Mikropartikeln eingefangen. Bei den in der Studie verwendeten Anti-NGAL-Abs handelt es sich um Mausantikörper. Das auf den Mikropartikeln eingefangene Fluoreszenzsignal von NGAL-Cy5 wurde verwendet, um die Bindungsaktivitäten von drei Ab-N3 mit unmarkiertem Ab zu vergleichen.

Im zweiten Ansatz wurden vier verschiedene Anti-NGAL-Antikörper und ein Anti-Biotin-Antikörper mit N3-NHS mit unterschiedlichen IRs im Bereich von 2 bis 6 markiert. Alle markierten Antikörper und ihre entsprechenden intakten Antikörper wurden in 10 mM HEPES-Puffer auf 100 pM verdünnt . 100 μl jeder Probe reagierten zunächst 30 Minuten lang mit 5 μl 0,1 % festem NGAL-beschichteten Mikropartikeln und dann 15 Minuten lang mit 50 μl 30 nM Ziegen-Anti-Maus-Antikörper F(ab')2-Dylight649. Die Mikropartikel wurden nach jedem Bindungsreaktionsschritt gewaschen und dann auf einem Olympus-Epifluoreszenzmikroskop abgebildet (Geräteaufbau und Bildanalyse wurden zuvor beschrieben24,25). Die mit Biotin-NGAL beschichteten Mikropartikel wurden durch Mischen von 10 μl 15 μM Biotin-NGAL mit 1 ml 0,1 % fester Streptavidin-Mikropartikel hergestellt. Ungebundenes Biotin-NGAL wurde vor jedem Experiment mit einem Plattenwaschgerät aus der Mikropartikellösung abgewaschen. Die mit Streptavidin beschichteten Mikropartikel wurden durch Kopplung von 0,1 mg/ml Streptavidin an 5 μm große paramagnetische Carboxylpartikel (Polymer Lab, Palo Alto, CA) hergestellt, die in Gegenwart von 0,15 mg/ml EDAC (1-Ethyl) bei einem Feststoffgehalt von 1 % (Gew./Gew.) gehalten wurden -3-(3-imethylaminpropyl)carbodiimid, Hydrochlorid. Streptavidin-Mikropartikel ohne die Beschichtung mit Biotin-NGAL wurden als Negativkontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass die gemessenen Signale eine spezifische Bindung zwischen dem Antikörper und seinem entsprechenden Antigen waren.

In dieser Studie wurden mehrere Markierungsbedingungen und Markierungsprodukte beschrieben. Der Klarheit halber wurden die folgenden Nomenklaturen verwendet: Protein-15×-N3-2×-AZ488, was bedeutet, dass das Protein zuerst mit dem 15-fachen Moläquivalent von N3-NHS und dann mit 2 reagiert × molares Äquivalent von AZ488-DBCO. Die Anzahl der an das Protein gebundenen N3-Moleküle wird als Einbauverhältnis (IR) bezeichnet. Die Anzahl der endgültigen Fluorophore, die an das Protein gebunden sind, wird als durchschnittlicher Markierungsgrad (aDoL) bezeichnet. Das Zwischenprodukt wird als Protein-N3 bezeichnet, das Endprodukt mit Fluorophoren wird als Konjugat bezeichnet.

Im ersten Beispiel wurde der Antikörper mit einem 16-fachen molaren Überschuss an N3-NHS aktiviert, wodurch ein IR von 5,6 erreicht wurde. Dann wurde ein Molverhältnis von 2:1 von AZ488-DBCO und Ab-16×-N3 gemischt, um einen aDoL von 2 zu erreichen. Das Reaktionsgemisch (Ab-16×-N3, AZ488-DBCO) wurde auf die analytische HPLC-Säule injiziert Es wurde mehrmals wiederholt, um den Reaktionsfortschritt zu überwachen, und das Produkt Ab-AZ488 wurde zur weiteren Analyse gesammelt. Abbildung 2a zeigt Beispiele für Chromatogramme, die im Zeitverlauf bei 493 nm aufgezeichnet wurden. Das Konjugat Ab-16×-N3-2×-AZ488 eluiert nach 8,8 Minuten, während das freie AZ488-DBCO nach 16,5 Minuten eluiert. Zu Beginn der Reaktion (5 Minuten) waren nur Spuren des Konjugats vorhanden und die meisten Fluorophore lagen in Form von freiem AZ488-DBCO vor. Nach 55 Minuten waren mehr als 50 % der Fluorophore an den Antikörper gebunden und nach 267 Minuten waren nur noch Spuren von freiem AZ488-DBCO vorhanden. Nach 24 Stunden wurde kein freies AZ488-DBCO von der Säule eluiert, was darauf hindeutet, dass das gesamte AZ488-DBCO an Ab-N3 gebunden war, sodass davon ausgegangen werden kann, dass wir den angestrebten aDoL von 2 erreicht haben. Abbildung 2b zeigt die kinetische Spur von Reaktion, extrahiert aus dem Elutionspeakwert bei 8,8 Min. Die kinetische Spur wurde dann unter Verwendung von Gleichung angepasst. (2) abgeleitet aus der integrierten Geschwindigkeitsgleichung für die Reaktion zweiter Ordnung (Gleichung 1).

wobei [A]0 und [B]0 die Anfangskonzentrationen von N3-DBCO bzw. AZ488-DBCO sind; t ist die Reaktionszeit in Sekunden, x ist die Konzentration von AZ488-DBCO, das an das Protein gebunden ist, und K ist die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante. Der angepasste K beträgt 4,31 ± 0,13/M/s.

(a) Chromatogramme von Ab-16×-N3, die mit 2× AZ488-DBCO reagieren, als Funktion der Zeit, aufgezeichnet bei 493 nm. Konjugat Ab-16×-N3-2×-AZ488 eluiert nach 8,8 Minuten, freies AZ488-DBCO eluiert nach 16,5 Minuten. (b) Reaktionskinetische Kurven, extrahiert aus den Chromatogrammen mit einem angepassten K-Wert von 4,31/M/s. (c) Absorptionsspektren der Konjugate aus verschiedenen Reaktionszeiten, gemessen mit dem PDA auf dem HPLC-Gerät. Die Legende zeigt die Reaktionszeit. (d) Autokorrelationskurven der Reaktion von AZ488-DBCO mit Ab-N3 als Funktion der Zeit. Die Kurven verschieben sich nach rechts, je mehr AZ488-DBCO kovalent an Ab-N3 gebunden ist.

Wir haben theoretisch und experimentell bestätigt, dass die Klickreaktion nach 24-stündiger Inkubation zu 100 % abgeschlossen war, vorausgesetzt, der DBCO-Tag und der N3-Tag wiesen eine Mindestkonzentration von 10 μM bzw. 25 μM auf. Allerdings beobachteten wir im zweiten Schritt je nach Größe der Nutzlast und angestrebtem DoL Änderungen der Reaktionsgeschwindigkeitskonstante oder eine unvollständige Reaktion, was möglicherweise eine längere Inkubation oder ein Ziel bei einem niedrigeren aDoL erfordern könnte (siehe ergänzender Abschnitt).

Abbildung 2c zeigt die Absorptionsspektren der Konjugate (aus verschiedenen Inkubationslängen) am Elutionspunkt 8,8 Minuten. Der erhöhte 495-nm-Peak weist darauf hin, dass sich im Laufe der Zeit mehr AZ488 an den Antikörper anlagerte. Die eingefügte Tabelle listet die aDoL auf, die aus jedem Absorptionsspektrum mithilfe der unten beschriebenen Gleichung berechnet wird. Nach 24-stündiger Inkubation erreichte das Konjugat einen aDoL von 1,8, was nahe am Zielwert von 2 liegt.

Parallel dazu wurden FCS-Messungen verwendet, um den Reaktionsfortschritt zu verfolgen. Die Reaktionsmischungen wurden ohne Reinigungsschritt am Mikroskop vermessen. Abbildung 2d zeigt die Autokorrelationskurven der Reaktionsmischung bei verschiedenen Reaktionszeiten. Die nach rechts verschobenen Autokorrelationskurven zeigen, dass im Laufe der Zeit mehr AZ488-DBCO an das Protein gebunden wird. Nach 24 Stunden wird die Autokorrelationskurve der ungereinigten Reaktionsmischung mit der des HPLC-gereinigten Konjugats überlagert, was darauf hinweist, dass das gesamte AZ488-DBCO mit Ab-N3 reagiert hat. Daher haben wir zwei unabhängige Methoden verwendet, um den 100-prozentigen Abschluss der Markierungsreaktion zu bestätigen.

0,5 mg Ab-17×-N3 wurden in 9 Aliquote aufgeteilt und jeweils mit 2× Moläquivalenten von AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO und Cy5-DBCO umgesetzt . Alle Produkte wurden nach ca. 24 Stunden Inkubation auf die analytische HPLC-Säule geladen und bei der maximalen Absorptionswellenlänge jedes entsprechenden Fluorophors überwacht. Nicht umgesetzte Rückstände wurden nur in den Proben AZ532-DBCO und AZ647-DBCO gefunden. Der Rest reagierte alle vollständig mit dem Protein (Abb. 3). Wir waren uns über die Ursache der unvollständigen Reaktion bei AZ532-DBCO und AZ647-DBCO nicht sicher, aber diese beiden Verbindungen sollten vermieden werden. Der Zweck dieses Experiments bestand darin, zu zeigen, dass das Protein-N3 nach dem Aktivierungsschritt parallel im Mikromaßstab mit Fluorophoren, Biotin oder anderen kleinen Nutzlasten mit DBCO-Tag konjugiert werden kann, ohne dass eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist. Man sollte jedoch eine 100-prozentige Reaktivität bestätigen des DBCO-Reagenzes mit N3-Tag beim ersten Test.

(a) HPLC-Elutionsprofil (normalisiert) der Konjugate (Ab-17X-N3-Fluorophor) nach ca. 24-stündiger Inkubation, jeweils überwacht bei der entsprechenden Fluorophorwellenlänge. (b) Absorptionsspektren der Konjugate bei einem Elutionspunkt von 8,8 Minuten.

Bisher wurden bei der Markierung von Proteinen mit AF488-SDP oder AF488-NHS immer nach nur wenigen Tagen Lagerung freie Fluorophore in der Konjugatlösung nachgewiesen. Es wurde vermutet, dass die Fluorophore während der Markierungsreaktion nicht kovalent an das Protein gebunden wurden und sich dann im Laufe der Zeit langsam vom Protein dissoziierten, was dazu führte, dass im gereinigten Proteinkonjugat freies Fluorophor vorhanden war. Wir sind der Meinung, dass N3-NHS in dieser Hinsicht weniger problematisch sein sollte. Das konjugierte Ab-AF488 (direkt über die SDP-Ester-Funktionsgruppe gebunden) und Ab-17×-N3-2×-AZ488 wurden am selben Tag hergestellt und am Tag 1 und Tag 100 mit dem FCS-Gerät gemessen. Nach 100 Tagen bei 2–8 °C wurden 15 % des freien AF488 im Ab-SDP-AF488-Konjugat nachgewiesen, während im über die SPAAC-Reaktion markierten Konjugat keine freien Fluorophore nachgewiesen wurden (siehe S. Abb. 5). Dieses direkte Vergleichsexperiment zeigte, dass unser Click-Labeling-Ansatz ein stabileres Konjugat erzeugen kann, was dadurch erklärt werden kann, dass nichtkovalent gebundenes Fluorophor-DBCO (sofern vorhanden) im Laufe der Zeit immer mit Protein-N3 reagieren kann.

Der Antikörper wurde zunächst mit einem 17-fachen, 34-fachen und 51-fachen molaren Überschuss an N3-NHS umgesetzt und erreichte einen IR von 7, 15 bzw. 24. Das Protein-N3 wurde dann mit AZ488-DBCO in Molverhältnissen von 2, 4, 6 und 8 umgesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Proben für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)-Messungen ohne Reinigung verdünnt. Wie erwartet reagierte AZ488-DBCO zu 100 % mit Ab-17×-N3 (IR 7) bei den aDoL-Zielen 2 und 4, es wurden jedoch Spuren von AZ488-DBCO für Ab-17×-N3 (IR 7) bei aDoL nachgewiesen Ziel von 6 und 8. Andererseits könnte Ab-34×-N3 (IR 15) bis zu 6 AZ488 pro Molekül aufnehmen, und Ab-51×-N3 (IR 24) könnte bis zu 8 AZ488 pro Molekül aufnehmen ( siehe S Abb. 4). Ein ähnliches Reaktionsprotokoll wurde mit apoMb durchgeführt und erreichte wie erwartet das angestrebte aDoL (siehe S Abb. 3). Diese Studie legt nahe, dass die IR des Protein-N3 das Doppelte des angestrebten aDoL betragen sollte, um den Abschluss der Klickreaktion sicherzustellen. Es ist jedoch bekannt, dass die Fluoreszenzhelligkeit von markiertem Protein aufgrund der Selbstlöschung, die manchmal auch als Konzentrationslöschung bezeichnet wird, nicht immer linear proportional zur Anzahl der daran gebundenen Fluorophore ist26,27. Bei den FCS-Messungen beobachteten wir die erwarteten Selbstlöschungsphänomene des markierten Proteins. Abbildung 4 zeigt, dass bei einem aDoL von 2 die Helligkeit des Konjugats doppelt so hoch ist wie die eines einzelnen Fluorophors AZ488-DBCO. Mit höherem aDoL kommt es zu einem inkrementellen Anstieg der Helligkeit, der jedoch nicht dem linearen Trend folgt. Bei einem aDoL von 8 beträgt die Helligkeit des Konjugats lediglich das Dreifache der Helligkeit des Fluorophors AZ488. Angesichts der potenziell negativen Auswirkungen einer umfassenden Markierung auf die Struktur und Funktion des Proteins und des minimalen Helligkeitsgewinns bei höherem aDoL28 ist es wichtig zu betonen, dass der aDoL niedrig gehalten werden sollte. Unter der Annahme, dass die Anzahl der Fluorophore pro Antikörper einer Poisson-Verteilung folgt18,29, gibt es selbst bei einem aDoL von ~ 2 ~ 18 % des Proteins mit 3 Markierungen und ~ 15 % des Proteins mit 4 und mehr Markierungen.

Aus FCS-Messungen berechnete Fluoreszenzhelligkeit der Konjugate. Bei einem aDoL von 2 ist die Helligkeit des Konjugats doppelt so hoch wie die des einzelnen Fluorophors AZ488-DBCO. Mit höherem aDoL steigt die Helligkeit schrittweise an, folgt jedoch nicht dem linearen Trend.

Die funktionelle Markierung N3- absorbiert weder bei 260 nm noch bei 280 nm, daher kann die Bindung von N3- an das Protein nicht durch das Absorptionsspektrum bestätigt werden. Proteine ​​mit unterschiedlichem IR haben sehr ähnliche Absorptionsspektren (siehe S Abb. 1). Wir haben zwei Methoden angewendet, um das Einbauverhältnis von N3- zu Protein zu bestimmen. Bei einem Ansatz reagiert das Protein-N3 mit einem molaren Überschuss an Cy5-DBCO. Wenn an jedem N3-Tag ein Cy5-DBCO angebracht ist, sollte der aDoL von Cy5 zu Protein-N3 den IR von Ab-N3 widerspiegeln und der aDoL kann bestimmt werden durch Absorptionsspektren. Dieser Ansatz eignet sich besser für größere Proteine ​​(z. B. Ab), die einen höheren Extinktionskoeffizienten und ausreichend Platz für die Unterbringung der Fluorophore aufweisen. In der Ergänzungstabelle 1 sind der Spitzenwert und der berechnete aDoL von Ab-N3-DBCO-Cy5 aufgeführt. Ein alternativer Ansatz besteht darin, ESI-MS zu verwenden und die Anzahl der N3- direkt durch die Massenzunahme des Proteins aufzulösen. Dies eignet sich besser für Proteine ​​kleinerer Größe ohne Glykosylierung (z. B. ApoMb). ESI-MS-Spektren von apoMb-N3 sind im Ergänzungsabschnitt enthalten (S Abb. 2). Tabelle 1 listet die IR von Ab-N3 und apoMb-N3 auf. Bei beiden Methoden sinkt die Reaktionseffizienz im Bereich von 25–47 %. Mit Ausnahme der übermarkierten Fälle liegen die Reaktionseffizienzen bei etwa 30 %, wobei die IR-Werte unter 5 liegen.

Zwei unabhängige Protokolle wurden verwendet, um die Bindungsaktivität des Antikörpers bei der -N3-Modifikation zu vergleichen. Im ersten Ansatz wurden Bindungstitrationskurven für Anti-NGAL Ab1 bei IRs von 0, 7, 15 und 24 durchgeführt. Jede Bindungskurve verfügt über 10 Datenpunkte. Alle Bindungskurven sind überlagerbar, was darauf hindeutet, dass die N3-Modifikation keinen Einfluss auf die Funktion des Antikörpers hat (Abb. 5a). Im zweiten Ansatz haben wir eine einfachere Methode übernommen, um mehr Antikörper mit unterschiedlichen IRs zu bewerten (siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“). Die Konzentrationen und Reaktionsbedingungen aller Reagenzien (NGAL-beschichtete Mikropartikel, Ziegen-Anti-Maus-Ab-Dylight 649) wurden gleich gehalten. Abbildung 5b zeigt das Fluoreszenzsignal der ursprünglichen und N3-markierten Antikörper bei der Bindung an ihr entsprechendes Antigen. Die fünf Antikörper haben eine inhärente unterschiedliche Affinität zu ihrem Zielantigen, was sich in den unterschiedlichen Signalpegeln für jeden Antikörper widerspiegelt. Allerdings spiegelt die Signalschwankung desselben Antikörpers, der mit unterschiedlichem IR markiert ist, die Auswirkung der Markierungsmodifikation wider. Abbildung 5c ​​zeigt das normalisierte Signal von markiertem Abs gegenüber intaktem Abs. Anti-NGAL Ab1 und Ab4 zeigten, dass die Bindung von N3 keinen negativen Einfluss auf die Funktion der Proteine ​​hat, während Anti-NGAL Ab2, Ab3 und Anti-Biotin Ab bei höheren IRs einen Verlust der Bindungsaktivität von bis zu 30 % aufwiesen. Und es gibt einen zunehmenden Trend zum Funktionsverlust mit zunehmender IR. Das Negativkontrollexperiment (mit Streptavidin beschichtete Mikropartikel) zeigte, dass alle Antikörper spezifisch an NGAL oder Biotin binden, das unspezifische Bindungssignal bei 100 pM Ab-Level ist vernachlässigbar.

(a) Bindungstitration von Ab1-N3 und seinem Antigen NGAL-Cy5. Unmarkierter Ab1 und Ab1-N3 wurden bei 100 pM gehalten, während die Konzentration von NGAL-Cy5 zwischen 10 pM und 5,5 nM variierte. Alle drei Ab-N3 weisen eine ähnliche Bindungsaktivität wie der native Ab auf, was auf einen minimalen Einfluss der N3-Anbindung an Ab hinweist. (b) Fluoreszenzsignal des Antikörpers, der vom entsprechenden Antigen eingefangen wird. (c) Relative Antikörperaktivität der N3-markierten Antikörper gegenüber dem entsprechenden intakten Antikörper.

Die hier vorgestellte Beschriftungstechnik ist unkompliziert und präzise. Uns ist keine bestehende Markierungsmethode bekannt, die die gleichen Merkmale aufweist, ohne eine Chemo- oder ortsselektive Markierung durchzuführen. Wie in der Einleitung erwähnt, besteht der Hauptnachteil der Verwendung von aktivem Ester-Fluorophor für die Proteinkonjugation darin, dass aDoL aufgrund der Instabilität des aktiven Ester-Fluorophors und der unvorhersehbaren Reaktionseffizienz nicht präzise kontrolliert werden kann. Nicht alle aktiven Ester-Tags sind gleich. Stark sulfonierte Farbstoffe wie die Alexa Fluor®-Farbstoffe, DyLight®-Farbstoffe und IRDye® sind besonders hygroskopisch und verschlechtern die Hydrolyse aktiver Ester zusätzlich. In einem Fall konnten wir mittels LC-MS 37 % des hydrolysierten Alexa Fluor® 488-NHS in einem frisch geöffneten Fläschchen nachweisen (siehe S Abb. 5). Im Herstellerhandbuch wird auch bestätigt, dass der Prozentsatz des aktiven Reagenzes normalerweise > 50 % beträgt, aber auch nur 30–40 % betragen kann. Da der Hydrolysegrad unbekannt ist und die Fluorophore sperrig sind, ist es schwierig, die Reaktionseffizienz vorherzusagen. Basierend auf unserer Erfahrung kann die Markierungseffizienz von AF488-NHS oder AF488-SDP auf Protein zwischen 5 und 50 % variieren. Während N3-NHS klein ist, weisen das intakte N3-NHS und das hydrolysierte N3-NHS unterschiedliche Absorptionsspektren auf, die zur Überprüfung der Integrität des Markierungsreagenzes verwendet werden könnten22. Wir haben verschiedene Markierungsverhältnisse von N3-NHS zu ApoMb und Antikörper getestet. Die Reaktionseffizienzen lagen für beide Proteine ​​bei ~ 30 %, wobei die IR unter 5 lag. Wir erwarten nicht für jedes Protein und jede N3-NHS-Charge eine Reaktionseffizienz von 30 % , aber es zeigt Konsistenz und Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus beträgt im Falle einer Übermarkierung jede zusätzliche N3-Anbindung nur 83 Dalton, was im Vergleich zu einem sperrigen Fluorophor weniger Auswirkungen auf die Funktion des Proteins hätte.

Der Nutzen dieser Methode wurde außerdem durch die parallele Markierung von 9 verschiedenen Fluorophoren an demselben Protein-N3 im Batch-Modus demonstriert. Nach dem Aktivierungsschritt kann das Protein-N3 parallel im Mikromaßstab mit Fluorophoren, Biotin oder anderen kleinen Nutzlasten mit DBCO-Tag konjugiert werden, ohne dass eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist. In einem kürzlich veröffentlichten Artikel30 versuchte der Autor, die Wirkung der Antikörper-Biotinylierung auf einen Immunoassay unter Verwendung verschiedener Linkerlängen und verschiedener aDoL auf drei Antikörper zu bewerten. Insgesamt wurden 150 Markierungsbedingungen durchgeführt, was 150 unabhängige Reinigungen erfordert. Wenn unser Ansatz verwendet worden wäre, würden die drei Antikörper zunächst mit N3-NHS aktiviert, nach der Reinigung könnte jeder Antikörper dann in 50 Aliquots aufgeteilt und mit verschiedenen Verhältnissen der 5 Linker umgesetzt werden, und das resultierende Produkt könnte direkt verwendet werden ohne weitere Reinigung. Die Gesamtzahl der Reinigungen wäre von 150 auf 3 reduziert worden.

Wie im Abschnitt „Ergebnis“ gezeigt, verringert sich der Nutzen mit höherem aDoL für die Fluorophormarkierung aufgrund der Selbstlöschung der Fluoreszenz und möglichen Auswirkungen auf die Funktion des Proteins. Wir haben fünf verschiedene Antikörper mit unterschiedlichen I.Rs getestet und den Einfluss von N3 auf die Proteinfunktion verglichen. Wie erwartet behielten einige Antikörper ihre Bindungsaktivität bei, während andere bei höheren I.Rs 30 % ihrer Bindungsfähigkeit an ihr Antigen verloren. Obwohl einige Proteine ​​mehr als 20 N3-Tags aufnehmen können, ist jedes Protein anders. Daher ist es wichtig, die Eigenschaften des Proteins nach jeder Modifikation zu bestätigen. Wir empfehlen die Einführung einer 3–5-N3-Anbindung an jedes Protein, was ausreicht, um im letzten Reaktionsschritt zwei DBCO-Fluorophore aufzunehmen. Es ist auch möglich, TCEP zu verwenden, um die nicht umgesetzte Azidogruppe am Protein nach der Reaktion mit DBCO wieder zu Amin zu reduzieren. Es ist jedoch wichtig zu bestätigen, dass das TCEP die Disulfidbindung des Proteins nicht aufgebrochen hat.

Insgesamt haben wir umfangreiche Studien durchgeführt, um zu zeigen, dass unser Ansatz eine einfache Möglichkeit bietet, Proteine ​​in geringer Menge parallel mit gut kontrolliertem aDoL zu markieren.

Die Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Durchschnittlicher Kennzeichnungsgrad

Beteiligungsverhältnis

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Referenzen herunterladen

Die Arbeit wurde von Abbott Laboratories unterstützt. Die Autoren danken Sergey Tetin für die aufschlussreiche Diskussion. Wir danken unserem Kollegen Rich Haack für die Charakterisierung von DBCO-Fluorophoren und AF488-NHS mittels LC-MS. Wir danken unserem Kollegen Patrick J. Macdonald für seine Kommentare, die das Manuskript erheblich verbessert haben. Wir danken Ray Zhao für die Erstellung hochauflösender Figurenbilder.

Angewandte Forschung und Technologie, Abbott Diagnostics Division, AP-20, Abbott Laboratories, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, IL, 60064-6016, USA

Qiaoqiao Ruan & Cheng Zhao

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QR hat die meisten der im Manuskript beschriebenen Experimente entworfen und durchgeführt. QR hat das Manuskript geschrieben. CZ führte einige der Experimente durch und beteiligte sich an der Ausarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Qiaoqiao Ruan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ruan, Q., Zhao, C. Eine Methode zur parallelen Proteinmarkierung im Mikromaßstab und zur präzisen Kontrolle des durchschnittlichen Markierungsgrads (aDoL). Sci Rep 13, 8961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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Eingegangen: 30. Januar 2023

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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