Biokonversion von 4

Mar 08, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1835 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Viehzucht und Arzneimittelabfälle führen zu einer erheblichen Anreicherung von Steroidhormonen und Östrogenen im Abwasser. Dabei wirken Östrogene als krebserregende Wirkstoffe und endokrine Disruptoren, die die sexuelle Entwicklung von Wassertieren beeinträchtigen und beim Menschen toxische Wirkungen haben. Umweltbakterien spielen eine entscheidende Rolle beim Östrogenabbau. Ihr großes Reservoir an Enzymen, wie Ringspaltungsdioxygenasen (RCDs), kann den Steroidkern abbauen und die Metaspaltung der A-, B- oder D-Steroidringe katalysieren. In dieser Arbeit wurden 4 Extra-Diol-Ringspaltungs-Dioxygenasen (ERCDs), PP28735, PP26077, PP00124 und PP00193, aus der marinen Sphingomonade Novosphingobium sp. isoliert. PP1Y und charakterisiert. Die kinetischen Parameter der Enzyme wurden auf verschiedenen synthetischen Catecholsubstraten bestimmt. Anschließend wurde die Biokonversion von Catecholöstrogenen bewertet. PP00124 erwies sich als wirksamer Katalysator für den Abbau von 4-Hydroxyestradiol (4-OHE2), einem krebserregenden hydroxylierten Derivat von E2. Eine vollständige 4-OHE2-Spaltung wurde unter Verwendung von PP00124 sowohl in löslicher Form als auch in ganzen rekombinanten E. coli-Zellen erreicht. LC-MS/MS-Analysen bestätigten die Bildung eines Semialdehydprodukts durch Metaspaltung des A-Rings. Nach unserem besten Wissen ist PP00124 das erste charakterisierte Enzym, das 4-OHE2 direkt über Meta-Spaltung abbauen kann. Darüber hinaus zeigte der vollständige biologische Abbau von 4-OHE2 unter Verwendung rekombinanter Ganzzellen Vorteile für biologische Sanierungszwecke auf.

Östrogene sind die wichtigsten Steroidhormone, die für die Regulierung des weiblichen Fortpflanzungssystems und die Entwicklung sekundärer Geschlechtsmerkmale verantwortlich sind1. Bei allen Wirbeltieren sind Östron (E1) und 17β-Östradiol (E2) die wichtigsten regulierenden Hormone (Abb. 1a). E2, das eine starke östrogene Aktivität mit Plasmakonzentrationen von bis zu 500 pg/ml bei weiblichen Säugetieren aufweist, gehört zu den Haupteffektoren für die Entwicklung des Fortpflanzungssystems beim Menschen2. Östrogene werden nach Hydroxylierung oder Sulfonierung im Urin ausgeschieden3; Mehrere Studien haben gezeigt, dass diese Verbindungen und insbesondere ihre hydroxylierten Formen (4-Hydroxyestradiol 4-OHE2 und 2-Hydroxyestradiol 2-OHE2, Abb. 1a) als endokrine Disruptoren und Karzinogene wirken können4,5.

Wichtigste östrogene Verbindungen und E2-Abbauwege. (a) Strukturen und Molekulargewichte (MW) von Östron (E1), 17 β-Östradiol (E2), Östratetraenol (E0), 4-Hydroxyestradiol (4-OHE2) und 2-Hydroxyestradiol (2-OHE2). Steroidringe AD sind rot markiert. (b) Wichtige E2-Abbauwege. i) E2 A-Ringhydroxylierung19. ii) E2 B-Ring-Hydroxylierung19. iii) E2-D-Ring-Dehydratisierung20. iv) E2-Dehydrierung zu E1 und anschließende D-Ring-Dehydrierung und -Spaltung21. iv.i) E2-Dehydrierung zu E1 und anschließende A-Ring-Dehydrierung und -Spaltung18. Der NB-Weg iv.i) folgt im Wesentlichen der gleichen A-Ringspaltungsreaktion wie Weg i). Es wird hier getrennt, da das Spaltungssubstrat 4-OHE1 im Weg iv.i) und 4-OHE2 im Weg i) ist.

Das Vorhandensein dieser schädlichen Verbindungen im Abwasser und in aquatischen Ökosystemen ist hauptsächlich auf die Ausscheidungen von Nutztieren bei der Viehzucht zurückzuführen6 und ist in letzter Zeit zu einem großen Umweltproblem geworden7,8,9; Diese Moleküle scheinen tatsächlich für die Beeinträchtigung der Entwicklung, Fruchtbarkeit und Fortpflanzungsfunktion bei Säugetieren, Fischen und Amphibienpopulationen verantwortlich zu sein. Tatsächlich wurden weltweit intersexuelle Fischpopulationen in Östrogen-kontaminierten Ökosystemen beobachtet[5,6,10,11,12 und Referenzen darin].

Die wachsenden Umweltbedenken haben in letzter Zeit das Interesse an den biologischen Prozessen, die am Östrogenabbau beteiligt sind, insbesondere von E2, und an der Identifizierung sowohl neuer potenzieller Abbauer als auch abbauender enzymatischer Aktivitäten verstärkt13. Der Abbau östrogener Kerne durch Zerstörung der aromatischen A-Ringstruktur ist der Schlüssel zur Behinderung der Wechselwirkung dieser Verbindungen mit der DNA und neutralisiert so ihre Aktivität und die daraus resultierende krebserzeugende Wirkung13,14. Mikrobielle Abbauprozesse spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Verbleibs und Transports von Östrogenen in der Umwelt. Bakterien, die über die spezifische katalytische Maschinerie zur vollständigen Zerstörung von Steroidkernen im metabolischen oder kometabolischen Modus verfügen, spielen eine zentrale Rolle bei der Umwandlung von Östrogenen in CO213,14,15.

Der biologische Abbau von Östrogen kann durch verschiedene Oxygenasen und Dehydrogenasen über verschiedene katabolische Wege katalysiert werden. Ringspaltungs-Dioxygenasen (RCD) spielen eine grundlegende Rolle beim Östrogenabbau und katalysieren die oxidative Spaltung hydroxylierter Östrogen-A-Ringe. Diese mikrobiellen Enzymfamilien spielen auch eine zentrale Rolle bei den Abbauwegen mono- und polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe und komplexer aromatischer Verbindungen (z. B. ermöglichen sie die Spaltung von Umweltschadstoffen und Ligninderivaten in der Umwelt). Oxygenasen sind in der Regel enzymatische Komplexe, die Cofaktoren nutzen und Redoxreaktionen mit Sauerstoff als Co-Reagens und NADH oder Eisen als Elektronendonor durchführen16. Der Abbauweg aromatischer Verbindungen in Bakterien kann im Allgemeinen in zwei Schritte unterteilt werden, die als oberer und unterer Weg bezeichnet werden17. Die Reaktionen der oberen Reaktionswege beinhalten die Aktivierung des aromatischen Rings durch Addition einer oder zweier Hydroxylgruppen an zwei benachbarte Kohlenstoffatome, oft katalysiert durch Monooxygenasen. Anschließend bewirken Dioxygenasen die oxidative Ringspaltung der Catecholverbindungen. Dioxygenasen werden üblicherweise in Intra- (IRCD) und Extra-Diol-Ringspaltungs-Dioxygenasen (ERCD) unterteilt18. IRCD-Enzyme spalten die Bindung zwischen den beiden Hydroxylgruppen und erzeugen eine Dicarbonsäureverbindung (ein Derivat der cis-Muconsäure). ERCDs katalysieren den Einbau von O2-Sauerstoff in Catecholderivate, spalten so eine der Bindungen neben dem Diol und erzeugen eine Alpha-Hydroxysäure mit einer Aldehyd- oder Ketongruppe (ein Derivat des cis-muconischen Semialdehyds). Diese Enzyme ermöglichen die Umwandlung dihydroxylierter aromatischer Moleküle in Zwischenprodukte des Tricarbonsäurezyklus (TCA), die von jeder Art von Organismus leicht verstoffwechselt werden können. Laut Yu und Mitarbeitern14 sind die mikrobiellen Abbauwege von Östrogenen in vier Hauptwege unterteilt, die in Abb. 1b zusammengefasst sind. Diese Abbauwege könnten auch in Abhängigkeit von den am ersten Abbauschritt beteiligten Steroidringen gruppiert werden: i) A-Ring: direkte E2-Hydroxylierung in C4 zur Bildung von 4-OHE2 und anschließende 4-OHE2-Spaltung über die sogenannte 4,5-Seco Weg, durchgeführt von ERCDs19; ii) B-Ring: E2-Abbau ausgehend von der Hydroxylierung des gesättigten B-Rings und anschließender Spaltung19; iii) D-Ring: direkter E2-Abbau über D-Ring-Dehydratisierung20; iv) D-Ring: Bei diesem Weg beinhaltet der erste Schritt immer eine Dehydrierung von E2 zu E1. Anschließend könnte E1 entweder dehydriert und am D-Ring gespalten werden (Weg iv)21,22 oder zu 4-OHE1 hydroxyliert und am A-Ring über den 4,5-Sekunden-Weg gespalten werden (Weg iv.i), ähnlich wie in i) beschrieben für 4-OHE219,23.

In den letzten Jahren wurde in verschiedenen Arbeiten die Isolierung neuer mikrobieller Enzyme beschrieben, die in der Lage sind, E2 abzubauen. Die meisten davon sind an der anfänglichen Dehydrierung von E2 zu E1 beteiligt, das dann hydroxyliert und gespalten wird, wie im iv.i)-Weg19,23 beschrieben. 24,25,26,27,28.

Bioprospektion ist von größter Bedeutung, um Licht auf die biochemischen Wege zu werfen, die am biologischen Östrogenabbau beteiligt sind, und um das enzymatische Werkzeugkasten für biotechnologische Anwendungen dieser Katalysatoren zu erweitern.

Novosphingobium sp. PP1Y ist wie andere Östrogen abbauende Bakterien ein marines Alpha-Proteobakterium der Ordnung Sphingomonadales, das aus stark verschmutzten Gewässern in Pozzuoli (Italien) isoliert wurde. Mehrere phänotypische Merkmale dieser Sorte, einschließlich der Möglichkeit, auf komplexen Mischungen aromatischer Moleküle zu wachsen, die in unpolaren Phasen wie Diesel und Benzin gelöst sind, deuten auf eine einzigartige metabolische Vielseitigkeit und die Fähigkeit hin, den biologischen Abbau komplexer polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) zu katalysieren. 29. Novosphingobium sp. Das PP1Y-Genom wurde vollständig sequenziert und mit Anmerkungen versehen30, und seine Analyse ergab das Vorhandensein von mehr als 40 mutmaßlichen ORFs, die für Mono- und Dioxygenasen kodieren, die ein beeindruckendes Reservoir an Oxygenase-Aktivitäten darstellen, die wahrscheinlich für die Fähigkeit dieses Stamms verantwortlich sind, ein breites Spektrum an Enzymen abzubauen mono-, bi-, tri-, tetra- und pentazyklische aromatische Verbindungen30,31.

In dieser Arbeit wurde der Mikroorganismus Novosphigobium sp. PP1Y wurde als neuartige Quelle für die Isolierung von ERCDs verwendet, die gegenüber Catecholöstrogenen aktiv sind. Die für vier ERCDs kodierenden Gene wurden rekombinant in E. coli exprimiert; Die entsprechenden Enzyme wurden charakterisiert und die kinetischen Konstanten auf verschiedenen katechischen Substraten gemessen. Anschließend wurde die Biokonvertierung von Catecholöstrogenen entweder unter Verwendung von Zellextrakten oder ganzen rekombinanten Zellen bewertet. Es wurde identifiziert und charakterisiert, dass ERCD PP00124 in der Lage ist, die vollständige Biokonvertierung von 4-OHE2 sowohl in löslicher Form als auch in ganzen rekombinanten Zellen über Meta-Spaltung zu katalysieren.

Die meisten bekannten ERCDs gehören zu einer heterogenen Proteinfamilie, die durch das Vorhandensein mehrerer Unterfamilien gekennzeichnet ist32. Jede Familie hat sich weiterentwickelt, um die Spaltung eines bestimmten Typs von substituiertem Brenzkatechin zu optimieren: 3- oder 4-Alkylbrenzkatechine, 3,4-Dihydroxyphenylacetat, 2,3-Dihydroxybiphenyl, 1,2-Dihydroxynaphthalin, 3,4-Dihydroxyphenanthren.

Die Genomanalyse des PP1Y-Stamms30 ergab das Vorhandensein von 7 Orfs, die für mutmaßliche ERCDs kodieren (drei davon in Doppelkopie mit 100 % Identität). Eine gründliche phylogenetische Studie, unterstützt durch eine Homologiemodellanalyse, ermöglichte die Hypothese der Rolle der sieben Enzyme im Stoffwechsel mono- und polyzyklischer aromatischer Verbindungen30. Insbesondere wurde die Hypothese aufgestellt, dass die orfs AT15671/AT31616, Mpl3065, AT15599/AT31688 und AT32663 jeweils für eine mutmaßliche (Di)(methyl)catechin-Dioxygenase, eine mutmaßliche Dihydroxybiphenyl-Dioxygenase und zwei Dihydroxynaphthalin/Dihydroxyphenanthren-Dioxygenasen kodieren. Im Folgenden werden diese Enzyme als PP00193, PP26077, PP00124 und PP28735 bezeichnet.

Die von D'Argenio et al.30 beschriebene Homologiemodellierungs-/Docking-Analyse legte nahe, dass die aktiven Zentren der genannten ERCDs in der Lage sein sollten, Brenzkatechine mit Substituenten an den Positionen 3 und/oder 4 zu beherbergen, die Abmessungen der Tasche des aktiven Zentrums jedoch progressiv Erhöhung der Bestellung PP00193 < PP26077 < PP00124 < PP28735. Sehr interessanterweise zeigten PP00124 und PP28735 Taschen des aktiven Zentrums, die groß genug waren, um dihydroxylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe mit 3–4 Ringen (z. B. Phenanthren, Anthracen, Benz[a]anthracen und Chrysen) und 4-OHE2 aufzunehmen, die aus sterischer Sicht ähnelt 1,2-Dihydroxychrysen (siehe ergänzende Abbildung S1). Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der vier ERCDs auf einer begrenzten Gruppe von Substraten, einschließlich 4-OHE2, bestätigte die hypothetische Rolle dieser Proteine ​​beim Metabolismus von polyzyklischem aromatischem Kohlenwasserstoff (PAH) im Stamm PP1Y30.

Daher wurden die 4 ERCDs als interessante Aktivitäten für das Screening auf Östradiol-Biokonversion ausgewählt. Die rekombinanten Expressionsbedingungen wurden in E. coli BL21(DE3)-Zellen optimiert, die mit den entsprechenden pET22b(+)-Vektoren transformiert wurden, deren Konstruktion zuvor beschrieben wurde30. Die Expressionsbedingungen wurden durch Testen verschiedener Wachstumstemperaturen, Induktionszeiten und IPTG-Konzentrationen optimiert, um aktive Enzyme zu erhalten. Um die Wachstumsbedingungen auszuwählen, haben wir die katalytische Aktivität von ERCDs auf 2,3-Dihydroxybiphenyl (2,3-DHBP) als Substrat in rekombinanten ganzen E. coli BL21(DE3)-Zellen (ergänzende Abbildung S2 a) während der Induktionsphase bewertet IPTG. Wie in der ergänzenden Abbildung S2 b gezeigt, wurden alle rekombinanten ERCDs in der löslichen Fraktion exprimiert, mit Ausnahme des Proteins PP28735, das hauptsächlich in der unlöslichen Fraktion vorhanden war, wie durch SDS-PAGE-Analyse der löslichen und unlöslichen Fraktionen nach der Zelllyse hervorgehoben wurde (Ergänzung). Abbildung S2 b). Das Expressionsniveau von Proteinen in löslicher Form (Ergänzungstabelle S1) wurde für PP26077, PP00124 und PP00193 auf 120, 40 bzw. 100 mg/L Kultur geschätzt, für das Enzym PP28735 jedoch nur auf 1–2 mg/L.

ERCDs wurden dann durch Anionenaustauschchromatographie auf einem Q-Sepharose FF-Harz gereinigt. Es wurde eine deutliche Instabilität aller ERCDs in Puffern ohne Fe(NH4)2(SO4)2 beobachtet, was darauf hindeutet, dass in Abwesenheit von exogenem Eisen im Puffer das Fe(II) im aktiven Zentrum leicht verloren geht oder zu Fe oxidiert wird (III) führt somit zur Enzyminaktivierung. Daher wurde ein Protokoll für eine schnelle „Batch“-Chromatographie erstellt, das die Verwendung eines Puffers mit 30 % Glycerin und 0,1 mM Fe(NH4)2(SO4)2 beinhaltete. Wie in der ergänzenden Abbildung S3 a gezeigt, lag die Ausbeute der Reinigungsverfahren zwischen 44 und 95 %, basierend auf der Bewertung des gereinigten aktiven Enzyms (endgültige Gesamteinheiten) im Vergleich zur Menge an aktivem Enzym in Zelllysaten (anfängliche Gesamteinheiten). Die SDS-PAGE-Analyse gereinigter Proteine ​​(ergänzende Abbildung S3 b) ergab das Vorhandensein von Kontaminanten bis zu 10–20 % der Gesamtproteine ​​für die ERCDs PP26077, PP00124 und PP00193, wohingegen gereinigtes PP28735 ein höheres Vorhandensein kontaminierender Proteine ​​aufwies, was höchstwahrscheinlich damit zusammenhängt die geringe anfängliche Proteinmenge in den löslichen Fraktionen der induzierten Kulturen.

Da alle Ringspaltungs-Dioxygenasen mit einem Fe(II)-Ion als Cofaktor im aktiven Zentrum ausgestattet sind, führt der fehlende Einbau von Fe(II) in das reife Protein oder seine Oxidation zu Fe(III) zu einer vollständigen Inaktivierung des Während der Dioxygenase-Aktivität haben wir den Eisengehalt mittels Ferene S-Assay gemessen. Die in der Ergänzungstabelle S1 angegebenen Ergebnisse verdeutlichen, dass der Gesamt-Fe(II)-Gehalt für die Proteine ​​PP26077, PP00124 und PP00193 jeweils 60 %, 100 % und 88 % beträgt. Die Ausbeute an Protein PP28735 in den gereinigten Fraktionen war zu gering, um die Eisenmenge zu messen. Darüber hinaus ermöglichte die Eisenanalyse die Schätzung, dass 25 % bzw. 7 % der Proteine ​​PP26077 und PP00193 eisenfrei waren, während die übrigen Fraktionen mit Fe(III) angereichert waren, was zu inaktiven Enzymen führte. Es ist erwähnenswert, dass das gereinigte PP00124-Protein am Ende des Expressions- und Reinigungsverfahrens 100 % Fe(II) beibehielt, was auf eine höhere enzymatische Stabilität im Vergleich zu den anderen ERCDs hinweist.

Anschließend wurden die spezifische Aktivität (SA) und die kinetischen Parameter der gereinigten ERCDs auf den vier ausgewählten Catechol-Substraten, 2,3-DHBP, 3-Methylcatechol (3MC), 4-Methylcatechol (4MC) und Catechol (CAT), bestimmt („Materialien und Methoden"). Die spezifische Aktivität der gereinigten RCDs wurde durch Überwachung der zeitlichen Bildung der entsprechenden cis-muconischen Semialdehyde gemessen. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass die Proteine ​​PP28735, PP26077 und PP00124 hauptsächlich auf 2,3-DHBP aktiv waren und niedrigere SA-Werte auf den anderen getesteten monoaromatischen Substraten zeigten. Umgekehrt war PP00193 auf CAT, 3-MC und 4-MC aktiver, wie aufgrund der Modellierungsergebnisse30 zu erwarten war, was darauf hinwies, dass dieses Enzym ein kleineres aktives Zentrum hat.

Die in Tabelle 2 zusammengefassten kinetischen Merkmale der 4 ERCDs zeigten, dass die Proteine ​​PP00124 und PP00193 eine höhere Aktivität gegenüber allen Substraten aufwiesen, wobei die KM-Werte zwischen 30 und 1 µM lagen. Wie erwartet schien PP00193 das beste Enzym für die Umwandlung von monoaromatischen Verbindungen und 2,3-DHBP zu sein und zeigte die höheren kcat/KM-Werte für diese Substrate. Im Gegensatz dazu zeigten die Proteine ​​PP28735 und PP26077 nur auf 2,3-DHBP, dem größeren Substrat, eine signifikante Aktivität, während sie auf monoaromatischen Brenzkatechinen KM-Werte von mehr als 450 µM aufwiesen. Tatsächlich zeigten diese Enzyme kcat/KM-Werte für die 2,3-DHBP-Umwandlung, die im Vergleich zu 3-MC zwischen 80 und 200 Mal niedriger waren. Protein PP00124 zeigte eine vergleichbare Aktivität auf allen getesteten Substraten, mit einer höheren Effizienz gegenüber 2,3-DHBP.

Die Biokonvertierung von Catecholöstrogenen unter Verwendung von ERCDs des Stammes PP1Y wurde getestet. Für die Biokonversionen wurden 4-OHE2 und 2-OHE2 als Substrate verwendet (Abb. 1a). Diese stammen aus der E2-Hydroxylierung und tragen die –OH-Substituenten an den Positionen 3, 4 bzw. 2, 3 des aromatischen Rings. Ausgehend von der zuvor durchgeführten molekularen Docking-Analyse30 sollten 4-OHE2 und 2-OHE2 besser in den aktiven Zentren von PP28735 und PP00124 untergebracht werden. Daher sollten diese Enzyme eine höhere Affinität zu den ausgewählten Catecholöstrogenen aufweisen. Vorläufige Daten aus unserer früheren Arbeit30 stützten diese Hypothese weiter. In dieser Arbeit wurde die SA der vier ERCDs für 4-OHE bestimmt (Tabelle 5 in30). Die Daten zeigten, dass die Proteine ​​PP28735 und PP00124 in der Lage waren, die Spaltung von 4-OHE2 in seinen mutmaßlichen cis-muconischen Semialdehyd zu katalysieren, wohingegen die Proteine ​​PP00193 und PP26077 eine vernachlässigbare Aktivität zeigten.

Um das beste Enzym für die 4-OHE2-Umwandlung auszuwählen, führten wir Zeitverlaufsexperimente (Abb. 2) durch, die mit PP28735- und PP00124-Proteinen mittels Spektrophotometeranalysen durchgeführt wurden. Reaktionen, die bei pH 7,5 in Gegenwart von 100 µM 4-OHE2 durchgeführt wurden, führten zur Bildung eines Reaktionsprodukts mit λmax bei 298 nm (Abb. 2). Innerhalb der Inkubationszeit von 4 (PP00124) und 8 (PP28735) Minuten wurden keine weiteren Veränderungen in den Spektren beobachtet, was auf eine vollständige Umwandlung von 4-OHE2 schließen lässt. Aufgrund der spektralen Eigenschaften der Spaltprodukte könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass die beiden Enzyme dieselbe Reaktion katalysieren. Es ist jedoch anzumerken, dass die aus der Meta-Spaltung von Catecholen erhaltenen Semialdehyde im Allgemeinen als gelbe Produkte mit λmax zwischen etwa 350 und 450 nm erscheinen, während das Spaltprodukt von 4-OHE2 im UV-Bereich der Spektren mit λmax bei 298 nm absorbiert wird. Es ist bekannt, dass die gelb gefärbten Formen die dianionische Form von Semialdehyden darstellen, die im Allgemeinen bei pH 7,5, bei dem die Reaktionen durchgeführt wurden, am häufigsten vorkommt33. Um die Eigenschaften der 4-OHE2-Umwandlungsprodukte durch die Proteine ​​PP28735 und PP00124 zu überprüfen, haben wir die Reaktionsmischung durch Zugabe von NaOH alkalisiert. Die in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellten spektralen Eigenschaften in alkalischem Puffer heben Produkte mit gelber Farbe (λmax bei 417 nm) hervor, wie für Semialdehyde erwartet, was die Ringspaltungsreaktion bestätigt und darauf hindeutet, dass ein höherer pH-Wert erforderlich ist, um die dianionische gelbe Form zu erhalten .

UV-Vis-Spektren des zeitlichen Verlaufs der enzymatischen 4-OHE2-Umwandlung. Die Reaktionen wurden unter Verwendung der Enzyme PP28735 (a) und PP00124 (b) in 1 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, mit 100 μM 4-OHE2 (gestrichelte schwarze Linien) durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe gereinigter Enzyme gestartet. Die Semialdehydproduktion wurde mit dem Scanning Kinetics-Programm auf dem Cary 100 UV-VIS-Spektrophotometer in einem Wellenlängenbereich von 230 bis 500 nm überwacht und die Absorption für 4–8 Minuten bei 25 °C aufgezeichnet (Graustufenlinien). Dicke schwarze Linien stellen die Spektren von Semialdehyd am Ende der Reaktion bei pH 7,5 (λmax 298 nm) dar.

Wir haben auch kinetische Analysen der 4-OHE2-Umwandlung durch die ERCDs durchgeführt, um den besten Katalysator auszuwählen. Die Produktbildung wurde spektrophotometrisch bei 298 nm überwacht, einer Wellenlänge, bei der keine Absorption für das 4-OHE2-Substrat aufgezeichnet wurde. Wie in Tabelle 3 angegeben, zeigte das Protein PP00124 die besten kinetischen Parameter für die Biokonversion von 4-OHE2 mit einem submikromolaren KM-Wert, was die Erstellung eines Biokonversionsprotokolls im kleinen Maßstab unter Verwendung von Zelllysaten von E. coli, die PP00124 as exprimierten, veranlasste Katalysator.

Wir testeten auch die Fähigkeit von ERCDs, 2-OHE2 zu spalten, es wurde jedoch für keines der Proteine ​​ein Umwandlungsprodukt beobachtet, was auf eine Selektivität dieser Enzyme gegenüber 4-OHE2 schließen lässt.

Basierend auf den interessanten kinetischen Eigenschaften des PP00124-Proteins haben wir die Kinetik der 4-OHE2-Spaltung durch PP00124-haltige Zellextrakte weiter untersucht und HPLC-Analysen durchgeführt.

Der vollständige Umsatz von 4-OHE2 wurde spektrophotometrisch verifiziert. Die aus der Reaktion erhaltenen Biokonversionsprodukte wurden dann mittels HPLC analysiert. Die in Abb. 3 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass unter unseren Versuchsbedingungen die vollständige Umwandlung von 4-OHE2 (Retentionszeit: 12,7 min und λmax: 279 nm, Tafel 3a) in ein Semialdehydprodukt (Retentionszeit: 11,4 min und λmax: 305 nm) erfolgte , Tafel 3b) wurde erhalten und bestätigte damit die spektrophotometrischen Analysen. Im Gegensatz dazu wurde bei Verwendung von 2-OHE2 als Substrat (Retentionszeit: 13,4 min und λmax: 286 nm) (Abb. 3, Tafeln c, d) zu keinem Zeitpunkt der Reaktion eine Umwandlung beobachtet, was wiederum mit spektrophotometrischen Analysen übereinstimmt . Diese Daten bestätigten die hohe Spezifität von PP00124 gegenüber Substraten, die Substituenten in den Positionen 3 und 4 der aromatischen A-Ringe tragen.

HPLC-Analyse der 4-OHE2- und 2-OHE2-Biokonversion unter Verwendung von rekombinantem PP00124 als Katalysator. Der Test wurde in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, bei 25 °C mit 100 µM bzw. 200 µM 4-OHE2 und 2-OHE2 durchgeführt. Aliquote der Reaktionsmischungen wurden vor der Zugabe des Enzyms gesammelt. Die Proben wurden angesäuert, 100-fach verdünnt, zentrifugiert und in HPLC als Negativkontrollen analysiert (in den Feldern (a) und (c) als Blindreaktionen dargestellt). Dann wurde PP00124-Zelllysat hinzugefügt, um die Reaktionen zu starten. Die Produktbildung wurde spektrophotometrisch über 15 Minuten verfolgt. Anschließend wurden die Proben angesäuert, 100-fach verdünnt, zentrifugiert und mit HPLC-Panels (b) und (d) analysiert. (a) HPLC-Chromatogramm der 4-OHE2-Blindreaktion und UV-Vis-Spektrum von 4-OHE. (b) HPLC-Chromatogramm der 4-OHE2-Reaktion: Semialdehyd-Reaktionsprodukt und entsprechendes UV-Vis-Spektrum. (c) HPLC-Chromatogramm der 2-OHE2-Blindreaktion und UV-Vis-Spektrum. (d) HPLC-Chromatogramm der 2-OHE2-Reaktion und entsprechendes UV-Vis-Spektrum. Alle gezeigten Chromatogramme wurden bei 280 nm aufgenommen.

Es wurde eine hochauflösende Massenspektrometrieanalyse der Umwandlungsprodukte durchgeführt. Aliquote der Blind- und Endpunktreaktionen wurden gesammelt und einer Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat unterzogen. Die erhaltenen Extrakte wurden mittels LC-MS/MS im Negativionenmodus analysiert. Es wurden zwei Hauptreaktionsprodukte nachgewiesen, die durch die PP00124-katalysierte Biokonversion von 4-OHE2 erzeugt wurden: zwei koeluierende Spezies mit Molekulargewichten von 306,1839 (gemessener m/z 305,1761, Abb. 4b) und 324,1951 (gemessener m/z 323,1873, Abb . 4c).

Hochauflösende MS-Spektren von 4-OHE2-Biokonversionsprodukten. Vollmassenspektren (MS1) wurden im Negativionenmodus aufgenommen. (a) 4-OHE2 m/z-Spektrum (m/z 287,1652). (b) m/z-Spektrum des 4-OHE2-Meta-Spaltungsprodukts (m/z 323,1873). (c) m/z-Spektrum des 4-OHE2-Cyclisierungsprodukts (hypothetisch). (m/z 305.1761).

Diese Daten bestätigten das Vorhandensein des 4-OHE2-meta-gespaltenen Semialdehydprodukts (theoretisches MW 324,1937), wie aufgrund des katalytischen Mechanismus von ERCDs, der die Insertion eines O2-Moleküls in das Substrat vermittelt, erwartet wurde34. Dies ist in Abb. 4 als Meta-Spaltungsprodukt angegeben. Das zweite Reaktionsprodukt könnte aus dem Meta-Spaltungsprodukt durch einen spontanen nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe an C4 auf die Carbonylgruppe an C5 und anschließende Dehydratisierung erzeugt werden (theoretisches MW 306,1831). Dies ist in Abb. 4c als Cyclisierungsprodukt (hypothetisch) angegeben. Die hypothetischen Strukturen dieser Verbindungen und die vorgeschlagene Reaktion sind in Abb. 5 dargestellt.

4-OHE2 hypothetischer Abbaumechanismus unter Verwendung von PP00124. Das Vorhandensein des 4-OHE2-meta-gespaltenen Semialdehydprodukts (theoretisches MW 324,1951) wurde durch Massenspektrometrie bestätigt. Dies steht im Einklang mit dem katalytischen Mechanismus von ERCD, der über eine O2-Insertion in das Substrat wirkt. Wir vermuten, dass die Bildung des zweiten Produkts durch eine Cyclisierung des Meta-Spaltungsprodukts mit dem spontanen nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe an C4 auf die Carbonylgruppe an C5 erfolgt. Die hypothetische Struktur dieser Verbindung (theoretisches MW 306,1839) wird als 4-OHE2-Cyclisierungsprodukt (hypothetisch) angegeben.

Nachdem die vollständige Umwandlung von 100 μM 4-OHE2 mit PP00124 bestätigt wurde, prüften wir die Möglichkeit, die 4-OHE2-Biokonversion mit ganzen Zellen als Biokatalysatoren zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden rekombinante E. coli-Zellen verwendet, die PP00124 exprimierten.

Nach der rekombinanten Expression wurden die Zellen getestet, um die rekombinante Proteinaktivität auf 2,3-DHBP zu testen. Es wurde eine spezifische Aktivität von 0,7 U2,3DHBP/OD gemessen. Insgesamt 3,5 Einheiten 2,3-DHBP (5 OD600) von PP00124 exprimierenden E. coli-Zellen wurden in Minimalmedium mit 100 μM (28 mg/L) 4-OHE2 inkubiert und ein Zeitverlaufsexperiment durchgeführt. Das Experiment wurde auch mit 10 OD600-Zellen von E. coli BL21(DE3) durchgeführt, die mit dem leeren pET22b(+)-Plasmid als Negativkontrolle transformiert waren. Zu jedem Zeitpunkt wurden PP00124-Zellen und negative Kontrollreaktionen von E. coli zweimal in Ethylacetat extrahiert und mittels HPLC-MS/MS analysiert. Bei Verwendung von mit dem leeren Plasmid transformierten E. coli-Zellen wurde kein 4-OHE2-Abbau beobachtet. Die für PP00124-exprimierenden Zellen erhaltenen Ergebnisse sind in Abb. 6 dargestellt. Wie bei der mit dem gereinigten Enzym durchgeführten Reaktion beobachtet, kam es zu einer schnellen Abnahme von 4-OHE2 (m/z 287) und im Laufe der Zeit zur Bildung der beiden durch 4-OHE2 erzeugten Verbindungen. Es war eine OHE2-Hydrolyse erkennbar (m/z 305 und 323). Interessanterweise war die kinetische Akkumulation dieser beiden Verbindungen nahezu überlagerbar, was darauf hindeutet, dass ein Gleichgewicht zwischen diesen beiden Spezies herrschte.

Biokonversion von 4-OHE2 in ganzen E. coli-Zellen unter Verwendung von rekombinantem PP00124 als Katalysator. Rekombinante E. coli-Zellen, die P00124 exprimierten, wurden bei 37 °C mit 100 μM 4-OHE2 in Minimalmedium inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots des Überstands gesammelt und angesäuert. Es wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat durchgeführt. Es wurden qualitativ-quantitative HPLC-MS/MS-Analysen durchgeführt. Vollmassenspektren (MS1) wurden im hochauflösenden Negativionenmodus aufgenommen. Peakflächen der extrahierten Ionenchromatogramme für jede Verbindung und jeden Zeitpunkt wurden registriert. Der zeitliche Trend von 4-OHE2 (m/z 287) und seinen Spaltprodukten (m/z 305 und 323) wird angezeigt. (a) 2-stündige Biokonversion im Zeitverlauf. (b) Detail der 20-minütigen Biokonversion. Die Daten werden in Fläche (%) angegeben und geben die relative Häufigkeit der Verbindungen an. Für jede Verbindung wurde die höhere registrierte Peakfläche als 100 %-Fläche festgelegt. Die Proben wurden dreifach analysiert und die Daten wurden als Mittelwert der gemessenen Flächen angegeben.

Die mit PP00124-exprimierenden Zellen durchgeführte Biokonversionsrate war deutlich langsamer als die mit dem gereinigten Enzym (oben beschrieben) durchgeführte. PP00124 kcat/KM ermöglichte jedoch eine vollständige Umwandlung von 4-OHE2 in 15 Minuten unter Verwendung von 3,5 Einheiten2,3-DHBP in 5 OD600. Bemerkenswert ist, dass unseres Wissens bisher keine Beispiele für den biologischen Abbau von 4-OHE2 in ganzen Zellen gemeldet wurden. Li und Mitarbeiter zeigten mithilfe eines mikrobiellen Konsortiums nach dreitägiger Inkubation bei 20 mg/l35 einen vollständigen Abbau von E2.

ERCDs erhalten Aufmerksamkeit für ihre potenzielle Verwendung bei der Biokonvertierung von Östrogen und östrogenähnlichen Verbindungen. Die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger enzymatischer Aktivitäten ist von größter Bedeutung, um Aufschluss über die biochemischen Wege zu geben, die Bakterienzellen zum Abbau dieser Moleküle entwickeln, die für die menschliche Gesundheit schädlich sein könnten. Darüber hinaus könnten ERCDs auch für biosynthetische Anwendungen eingesetzt werden, indem die ortsspezifische Ringspaltung dieser Enzyme ausgenutzt wird36,37. Ihre Substratspezifität könnte für die Biosynthese von Feinchemikalien optimiert werden.

Eine zuvor veröffentlichte Bioprospektionsanalyse von Novosphingobium sp. Das PP1Y-Genom zeigte eine bemerkenswerte Fülle an RCDs, die es dem Stamm PP1Y wahrscheinlich ermöglichen, komplexe Mischungen von Katechinen zu metabolisieren, die aus der gleichzeitigen Oxidation mehrerer mono- und polyzyklisch-aromatischer Kohlenwasserstoffe stammen, die die bevorzugten Wachstumssubstrate für diesen Stamm sind 29, 30.

Diese Arbeit beschreibt eine kinetische Charakterisierung von vier ERCDs, die zuvor aus Novosphingobium sp. isoliert wurden. PP1Y30. Ihre Substratspezifität wurde untersucht und ein vollständiger biologischer 4-OHE2-Abbau wurde unter Verwendung des Proteins PP00124 entweder mit rekombinanten ganzen Zellen oder Zelllysaten erreicht.

Kinetische Parameter für CAT, 3-MC, 4-MC und 2,3-DHBP der 4 ERCDs wurden bestimmt. Die erhaltenen Daten bestätigten die Homologiemodellierung/Docking-Analyse, die zuvor für die Enzyme von D'Argenio et al. durchgeführt wurde. (30 und ergänzende Abbildung S7 darin). Tatsächlich hatte das Protein PP00193 die höhere Effizienz beim Abbau monoaromatischer Verbindungen und zeigte kcat/KM-Werte im Bereich von 115 bis 64 s−1 µM−1. Diese Werte schienen vergleichbar oder sogar höher zu sein als die, die für ähnliche Enzyme aus Pseudomonas putida mt-2 und Burkholderia sp. beschrieben wurden. LB40038,39,40. Protein PP00124 zeigte eine vergleichbare Aktivität auf allen von uns getesteten Substraten, jedoch mit einer höheren Effizienz gegenüber 2,3-DHBP. Obwohl die kcat/KM-Werte der Proteine ​​PP00124 und PP00193 gegenüber diesem Substrat nicht höher waren als die für andere Biphenyldioxygenasen (wie die von Sphingomonas sp. RW1 und Burkholderia sp. LB400) beschriebenen Werte, sind diese Proteine ​​​​aus dem Stamm PP1Y insgesamt ausgestattet mit der Fähigkeit, mehrere 3- und/oder 4-substituierte Catechole zu spalten, was für andere Enzyme, die bereits in der Literatur beschrieben wurden, nicht beschrieben wurde40,41. Im Gegensatz dazu hatte das Protein PP26077 eine sehr geringe Aktivität auf diesen Substraten und scheint erwartungsgemäß eine höhere Affinität für Moleküle mit einem Substituenten senkrecht zum aromatischen Ring zu haben, wie bei 2,3-DHBP.

Für die 4-OHE2-Spaltung erwies sich PP00124 als der beste Katalysator. Die HPLC-MS/MS-Analyse zeigte die vollständige Substratbiokonvertierung nach 15-minütiger Reaktion. Es wurde keine Umwandlung von 2-OHE2 beobachtet, was auf eine hohe Spezifität des Enzyms für 2,3-substituierte A-Ringstrukturen schließen lässt. Die proximale Östradiolspaltung des 3- oder 4-substituierten Catecholrings unter Bildung von 2-Hydroxymuconat-Semialdehyd mit der Insertion von zwei Disauerstoffatomen wurde, wie für den ERCD-Reaktionsmechanismus erwartet, durch die Erzeugung eines 323,187 m/z-Produkts (287) beobachtet + 36 = 323 m/z-Ion)34,38. Die Ergebnisse zeigten jedoch auch die Bildung einer Verbindung mit 305,176 m/z, die wahrscheinlich durch spontane intramolekulare Cyclisierung unter Eliminierung eines Wassermoleküls entstand. In Abb. 5 ist eine Darstellung der hypothetischen Struktur des Cyclisierungsprodukts dargestellt. Die beiden Produkte schienen gleichzeitig erzeugt zu werden und während der Reaktion im Laufe der Zeit im Gleichgewicht zu bleiben (Abb. 6). Es könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass das Cyclisierungsprodukt aus dem semialdehydischen Meta-Spaltungsprodukt durch einen nukleophilen Angriff und Dehydratisierung und die Bildung eines heterocyclischen Rings in A-Position erzeugt wird (Abb. 5). Andere Arbeiten beschrieben die Bildung einer ähnlichen heterozyklischen Verbindung, Pyridinestronsäure, durch eine spontane abiotische Reaktion in Gegenwart eines Stickstoffdonors im Medium24. Daher steht die Bildung eines ähnlichen Sekundärprodukts, wie z. B. eines Cyclisierungsprodukts, mit den zuvor berichteten Daten im Einklang. Auch wenn für die vollständige Charakterisierung des Reaktionsmechanismus weitere Analysen erforderlich wären, deuten unsere Daten auf PP00124 aus Novosphingobium sp. PP1Y soll ein effizienter Biokatalysator für den biologischen Abbau von 4-OHE2 sein. Nach unserem besten Wissen beschreiben wir hier die Isolierung und Identifizierung in Novosphingobium sp. PP1Y des ersten ERCD, das 4-OHE2 über Meta-Spaltung direkt abbauen kann und wahrscheinlich am i) 4,5-Seco-Weg beteiligt ist. Obwohl der biologische Abbau von 4-OHE2 bereits früher berichtet und als möglicher natürlicher Abbauweg in Rhodococcus sp. identifiziert wurde. ED6 und Sphingomonas sp. ED8 von Kurisu et al.19, nach unserem besten Wissen PP00124 aus Novosphingobium sp. PP1Y ist das erste charakterisierte ERCD, das dieses Substrat spaltet. Umgekehrt beschreiben mehrere neuere Arbeiten die Charakterisierung mikrobieller Enzyme, die an den Abbauwegen ii), iv) und iv.i) beteiligt sind (Abb. 1), die die Spaltung des östrogenen Kerns von 4-OHE1 beinhalten. In diesen Beispielen ist jedoch immer eine anfängliche Dehydrierung des D-Rings an E2 und eine Umwandlung in E1 der erste Schritt (Abb. 1)24,26,27,28.

Schließlich zeigten Experimente zur Biokonversion ganzer Zellen in dieser Arbeit einige interessante Vorteile bei der Verwendung rekombinanter ganzer Zellen gegenüber nativen Bakterien als Biokatalysatoren auf. Mehrere Arbeiten berichteten über den biologischen Abbau von Östrogen unter Verwendung verschiedener Umweltstämme oder Konsortien35. Auch wenn dieser Ansatz bei biologischen Sanierungszwecken von großem Nutzen sein könnte, heben wir hier die Vorteile der Verwendung rekombinanter Stämme hervor, um den biologischen Abbau bestimmter Verbindungen zu verbessern. Tatsächlich waren ganze E. coli-Zellen, in denen die rekombinante Expression von PP00124 induziert wurde, in der Lage, 4-OHE2 mit hoher Effizienz und in kurzer Zeit effektiv abzubauen, was darauf hindeutet, dass das Biokonversionsprotokoll ganzer Zellen als effizienter Ansatz zur Vermeidung angesehen werden könnte die zeit- und kostenaufwändigen Schritte der Proteinreinigung. Darüber hinaus könnte ein ähnlicher Ansatz für den Abbau verschiedener widerspenstiger Verbindungen angenommen werden, die von Wildtyp-Umweltstämmen und -Konsortien immer noch schlecht metabolisiert werden.

Bakterienkulturen, Plasmidreinigungen und Transformationen wurden gemäß Sambrook et al.42 durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard gemessen. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt und mit Coomassie Brilliant Blue G-250 gefärbt. 4-OHE2- und 2-OHE2-Standards wurden von Cayman Chemicals bezogen. Das Bakterienwachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm, OD/ml, auch als OD600 bezeichnet, verfolgt. LB-reiches Medium (Luria Bertani-Medium) wurde wie in Sambrook et al.42 beschrieben hergestellt.

Das Plasmid pET22b(+), das die Orfs enthält, die für die Proteine ​​PP28735, PP26077, PP00124 und PP00193 kodieren, wurde gemäß Sambrook et al.42 zur Transformation kompetenter E. coli BL21(DE3)-Zellen verwendet. Die Kolonien wurden in einem sterilen 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 12,5 ml LB-Medium, ergänzt mit 100 µg/ml Ampicillin (Amp), inokuliert. Die Kulturen wurden bei 37 °C unter ständigem Schütteln bis zu ~ 0,7 OD600 inkubiert. Das Vorinokulum wurde 1:50 in 500 ml LB/Ampere verdünnt und unter ständigem Schütteln bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,6–0,7 inkubiert. Die Expression wurde durch Zugabe von 0,1 mM Fe(SO4)2(NH4)2 und IPTG zwischen 0,025 und 0,4 mM induziert. Das Wachstum wurde weitere 2 oder 4 Stunden bei 28 ° C oder 37 ° C fortgesetzt (Ergänzende Abbildung S2). Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (5524 × g für 15 Minuten bei 4 °C) gesammelt und die Zellpellets bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Zellpaste, die aus groß angelegten Expressionsexperimenten erhalten wurde, wurde zunächst in Lysepuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 % Ethanol, 30 % Glycerin, 5 mM DTT und 0,1 mM Fe(SO4)2(NH4)2) bei a suspendiert Endkonzentration von 50–100 OD600 und dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen (20 Mal für einen 15-Zoll-Ein- und 55-Zoll-Aus-Zyklus auf Eis). Lösliche und unlösliche Fraktionen der induzierten Kulturen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 22.100 × g und 4 ° C getrennt und der Überstand gesammelt und durch eine 0,45 μm PVDF Millipore-Membran filtriert.

Die Proteine ​​PP26077, PP00124 und PP00193 wurden ansatzweise auf Q-Sepharose FF-Anionenaustauscherharz (Pharmacia Biotech) gereinigt. Die Proben wurden 1 Stunde lang mit dem Harz unter ständigem Schütteln bei 4 °C inkubiert und die ungebundenen Proteine ​​wurden durch Zentrifugation und drei anschließende Wäschen in Lysepuffer entfernt. Die Elution erfolgte schrittweise in Lysepuffer mit 0,2, 0,4, 0,6 und 0,8 M NaCl. Das Harz wurde dreimal mit jeder Lösung 10 Minuten lang unter ständigem Schütteln bei 4 °C inkubiert. Die Fraktionen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei –80 ° C unter Stickstoffatmosphäre gelagert. Die Reinheit der Proben wurde durch SDS-PAGE bewertet. Das Vorhandensein aktiver rekombinanter ERCDs wurde durch die Durchführung des enzymatischen Tests an 2,3-DHBP, wie unten beschrieben, nachgewiesen. Darüber hinaus wurden alle Manipulationen unter einem konstanten Stickstoffstrom durchgeführt, um eine übermäßige Eisenoxidation zu verhindern.

Protein PP28735 wurde durch Q-Sepharose-FF-Säulenchromatographie gereinigt. Die Proteinelution erfolgte über einen linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Lysepuffer mit einer Flussrate von 15 ml/h. Das Vorhandensein des aktiven rekombinanten ERCD wurde durch die Durchführung des enzymatischen Tests an 2,3-DHBP nachgewiesen. Relevante Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gepoolt, mit Stickstoff gespült und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Der Gesamteisengehalt wurde kolorimetrisch durch Komplexierung mit Ferene S43 (3-(2-Pyridyl)-5,6-bis[2-(5-furylsulfonsäure)]-1,2,4-triazin, Dinatriumsalz, bestimmt spezifischer Chelatbildner für Fe (II), der zur Bildung eines farbigen Komplexes führt, dessen Absorption bei einer Wellenlänge von 593 nm (ε593 nm = 34,32 mM−1 cm−1) gemessen wird. Um die Gesamtmenge an Fe [Fe (II) + Fe (III)] zu bestimmen, wurde der Test auch in Gegenwart von Vitamin C (Endkonzentration 6 mM) durchgeführt, um Fe (III) zu Fe (II) zu reduzieren. Die Menge an Fe (III) wurde berechnet, indem die Menge an Fe (II) (gemessen in Abwesenheit von Vitamin C) von der Gesamtmenge an Fe (gemessen in Gegenwart von Vitamin C) abgezogen wurde. Kalibrierungskurven für Fe (II) und Fe (III) wurden durch Testen bekannter Mengen (5–20 nmol) Fe(NH4)2(SO4)2 bzw. FeCl3 erhalten. Da der chromatographische Schritt die Anwesenheit von Fe(II) und DTT im Elutionspuffer erforderte, war es notwendig, diese Reagenzien zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde eine Niederdruck-Molekularausschlusschromatographie an einer vorgepackten PD-10-Säule von Pharmacia durchgeführt (Säulengröße: 0,8 cm × 5 cm mit einem Gesamtharzvolumen von 9,1 ml). Die Elution erfolgte bei Raumtemperatur in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, 10 % Glycerin, 0,2 M NaCl.

Die Aktivität der ERCDs wurde bei 25 °C durch Messung ihrer spezifischen Aktivität (SA) unter Verwendung von CAT, 3-MC, 4-MC und 2,3-DHBP bestimmt. Substrat-Stammlösungen wurden 100 mM in Wasser für CAT, 3MC, 4MC und in Dimethylformaldehyd (DMF) für 2,3-DHBP hergestellt. Ihre Konzentration wurde spektrophotometrisch in 10 mM HCl gemessen. Die Proben wurden bei 25 °C in einem Gesamtvolumen von 1 ml 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, das Substrat in einer Endkonzentration von 1 mM enthielt, untersucht. Die Reaktionen wurden durch Zugabe variabler Mengen ganzer rekombinanter Zellen (0,03 bis 0,3 OD600), löslicher Fraktionen aus Zelllysaten (0,03 bis 0,3 OD600) oder gereinigter Proteine ​​(1–50 µg) gestartet und nach der Bildung 3 Minuten lang spektrophotometrisch über die Zeit überwacht die entsprechenden cis-muconischen Semialdehydprodukte. Die Absorption wurde alle 5 s bei λmax jedes Substratprodukts (Ergänzungstabelle S2) aufgezeichnet. Die zur Berechnung der Menge jedes erhaltenen Produkts verwendeten λmax- und Extinktionskoeffizienten (ε) sind in der Ergänzungstabelle S2 angegeben. Eine Enzymeinheit wurde als die Menge des Enzyms definiert, die bei 25 °C ein µmol cis-Mucon-Semialdehyd pro Minute freisetzt.

Die Stammlösungen der Substrate wurden 100 mM in Ethanol hergestellt. Ihre Konzentration wurde spektrophotometrisch in 10 mM HCl gemessen, indem die Absorption bei ihrem λmax entsprechend 276 nm und 286 nm für 4-OHE2 bzw. 2-OHE2 aufgezeichnet wurde. ε von 3-MC und 4-MC (Ergänzungstabelle S2) wurden für 4-OHE2 bzw. 2-OHE2 verwendet. Aktivitätstests wurden in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, bei 25 °C mit unterschiedlichen Mengen an ERCDs enthaltenden ganzen rekombinanten Zellen (0,03 bis 0,3 OD600), löslichen Fraktionen aus Zelllysaten oder gereinigten Proteinen (1–50 µg) durchgeführt , 30–400 mU2,3-DHBP), in Gegenwart von 100 µM und 200 µM 4-OHE2 bzw. 2-OHE2, die ihre Löslichkeitsgrenzen in wässrigen Puffern darstellen.

Zeitverlaufsexperimente zur Umwandlung von 4-OHE2 (100 µM) und 2-OHE2 (200 µM) wurden mit dem Varian Cary 100 UV-Vis-Spektrophotometer durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der gereinigten ERCDs (1–50 µg) gestartet und die Bildung der Produkte wurde bei pH 7,5 mit dem Scanning Kinetics-Programm in einem Wellenlängenbereich von 230 bis 500 nm überwacht. Die Umwandlung von 4-OHE2 (λmax 285 nm) in Semialdehyd (λmax 298 nm) wurde durch die Aufnahme der Absorptionsspektren für 4–8 Minuten bei 25 °C verfolgt. Am Ende der 4OHE2-Spaltung wurde NaOH (100 mM Endkonzentration) zugegeben, um den Semialdehyd in die gelbe dianionische Form (λmax 417 nm, bei alkalischem pH-Wert) umzuwandeln, und das Spektrum wurde aufgezeichnet.

Um außerdem die Identifizierung des 4-OHE2-Substrats und seines Produkts durch HPLC-Analysen zu vereinfachen, wurde der Reaktion, die den nach 10-minütiger Inkubation wie oben beschrieben erhaltenen Semialdehyd enthielt, 1 % Ameisensäure zugesetzt und das Spektrum aufgezeichnet. Für 4-OHE2 und seinen Halbaldehyd wurden bei saurem pH-Wert λmax-Werte von 280 bzw. 305 nm gefunden.

Um die Bestimmung der spezifischen Aktivität und der kinetischen Konstanten zu ermöglichen und die Semialdehydproduktion durch ERCDs bei pH 7,5 (über die Reaktionsinkubationszeit) und bei pH 12 (am Ende der Reaktion) zu quantifizieren, wurde der ε für das 4-OHE2-Semialdehydprodukt bei pH 7,5 bestimmt und pH 12 wurden experimentell bestimmt. Kurz gesagt, die vollständige Umwandlung verschiedener Östradiolsubstratkonzentrationen (20 µM, 40 µM, 60 µM, 80 µM und 100 µM) wurde unter Verwendung von 400 mU2,3DHBP von ERCD PP00124 in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5-Puffer durchgeführt. Die Spektren wurden wie oben beschrieben mit dem Scanning Kinetics-Programm aufgezeichnet und die Extinktionskoeffizienten wurden bestimmt (ε298 nm bei pH 7,5 = 9,1 mM−1 cm−1; ε417 nm bei pH 12 = 21,78 mM−1 cm−1). maximale Wellenlängen. Eine Einheit Enzymaktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, die bei 25 °C ein µmol Semialdehyd pro Minute freisetzt.

Kinetische Parameter wurden in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, unter Verwendung von 1 bis 50 µg gereinigten Proteinen und CAT, 3-MC, 4-MC und 2,3-DHBP als Substraten im Bereich von 0,5 µM–16 mM ermittelt. 4-OHE2 wurde in Endkonzentrationen von 0,5 bis 100 µM (Löslichkeitsgrenze in Wasser) verwendet. Die Reaktionen wurden 3 Minuten lang bei 25 °C bei 375 nm (CAT; ε375 nm = 33 mM−1 cm−1), 388 nm (3-MC; ε388 nm = 13,8 mM−1 cm−1), 382 nm (4- MC; ε382nm = 28,1 mM−1 cm−1), 434 nm (2,3-DHBP; ε434nm = 13,2 mM−1 cm−1) und 298 nm (4-OHE2; ε298nm = 9,1 mM−1 cm−1) . Die verwendeten Extinktionskoeffizienten sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Alle kinetischen Parameter wurden durch eine nichtlineare Regressionskurve mit GraphPad Prism 7 bestimmt.

Die enzymatische Umwandlung von 4-OHE2 und 2-OHE2 wurde mit dem Enzym PP00124 durchgeführt. Die Reaktionen wurden wie im vorherigen Absatz beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, der Test wurde in 1 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, bei 25 °C in Gegenwart von 100 µM bzw. 200 µM 4-OHE2 und 2-OHE2 durchgeführt. Ein Aliquot (0,5 ml) der Reaktionsmischungen wurde vor der Zugabe des Enzyms gesammelt und mit einer Endkonzentration von 1 % Ameisensäure versetzt. Die Proben wurden 100-fach verdünnt, 5 Minuten bei 22.100 × g zentrifugiert und als Negativkontrolle (Blindreaktionen) einer HPLC unterzogen. Anschließend wurde den Proben PP00124-Zelllysat zugesetzt, um Reaktionen auszulösen. Die Produktbildung wurde spektrophotometrisch über eine Gesamtzeit von 15 Minuten zwischen 230 und 500 nm verfolgt, wobei alle 5 Sekunden Spektren aufgezeichnet wurden. Anschließend wurden die Reaktionen durch Zugabe von 1 % Ameisensäure gestoppt. Halbaldehydspektren wurden bei saurem pH-Wert aufgezeichnet und die Proben 100-fach verdünnt, 5 Minuten bei 22.100 × g zentrifugiert und mittels HPLC analysiert.

Es wurde eine Waters 1525-Binärpumpen-HPLC mit einem Photodiodenarray-Detektor (Waters 2996), ausgestattet mit einer C18-Ultrasphere-Säule (Beckman Coulter 4,6 mm × 25 cm), verwendet. Von jeder Probe wurden zweihundert Mikroliter injiziert. Eine lineare Gradientenelution wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min unter Verwendung einer mobilen Phase bestehend aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % Ameisensäure in Methanol (Lösungsmittel B) durchgeführt. Die Elution von 4-OHE2, 2-OHE2 und den entsprechenden Produkten wurde unter Verwendung des folgenden Gradienten durchgeführt: isokratische Elution bei 10 % Lösungsmittel B für 3 Minuten, von 10 bis 50 % Lösungsmittel B in 3 Minuten, von 50 bis 75 % Lösungsmittel B in 15 Min., von 75 auf 90 % Lösungsmittel B in 1 Min., isokratische Elution bei 90 % Lösungsmittel B für 1 Min., von 90 auf 10 % Lösungsmittel B in 1 Min., isokratische Elution bei 10 % Lösungsmittel B für 3 Min. Spektren des eluierenden Lösungsmittels wurden mit dem Photodiodenarray-Detektor zwischen 230 und 400 nm registriert. Chromatogramme wurden zur Überwachung der Absorption bei 280 nm erstellt, da sowohl Substrate als auch Produkt bei dieser Wellenlänge Absorption aufweisen.

Schließlich wurden auch Aliquots der Blind- und Endpunkt-Reaktionsmischungen für die LC-MS/MS-Analyse gesammelt. Aliquote wurden 30 s lang bei 22.100 × g zentrifugiert. Überstände wurden gesammelt und Ameisensäure in einer Endkonzentration von 1 % zugegeben, um die Reaktion zu stoppen; Die Proben wurden dann über Nacht bei –20 ° C gelagert. Anschließend wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat durchgeführt, um 4-OHE2 und die Reaktionsprodukte zu reinigen. Den Proben wurden fünf Volumina Ethylacetat zugesetzt und 20 s lang gevortext. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 22.100 × g zentrifugiert und die organische Phase gesammelt. Die wässrige Phase wurde dann einer zweiten Flüssig-Flüssig-Extraktion mit demselben Protokoll unterzogen. Alle organischen Phasen wurden vakuumgetrocknet und für die LC-MS/MS-Analyse in 60 μl 50 % MeOH suspendiert.

Die rekombinante Expression des Proteins PP00124 wurde wie zuvor beschrieben induziert. Als Negativkontrolle wurden auch 250 Milliliter Kulturen von E. coli BL21(DE3) gezüchtet, die mit dem leeren Plasmid pET22b(+) transformiert waren. Nach 2 Stunden Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und bei 5 OD600 in Minimalmedium (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,0), ergänzt mit 0,4 % Glucose und 1 mM Fe(NH4)2(SO4)2, suspendiert. Abschließend wurden dem Medium 100 μM 4-OHE2 zugesetzt und die Zellen wurden bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubiert. Aliquote von 500 μl wurden zu den folgenden Zeitpunkten gesammelt: 0, 1, 2, 3,5, 5, 7,5, 10, 15, 30, 60 und 120 Minuten. Aliquote wurden 30 s lang bei 22.100 × g zentrifugiert. Überstände wurden gesammelt und Ameisensäure in einer Endkonzentration von 1 % zugegeben, um die Reaktion zu stoppen; Die Proben wurden dann über Nacht bei –20 ° C gelagert. Anschließend wurde eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat durchgeführt, um 4-OHE2 und die erhaltenen Reaktionsprodukte zu reinigen, wobei dem gleichen Verfahren gefolgt wurde, das im vorherigen Absatz beschrieben wurde; Den Proben wurden fünf Volumina Ethylacetat zugesetzt und 20 s lang gevortext. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 22.100 × g zentrifugiert und die organische Phase gesammelt. Die wässrige Phase wurde dann einer zweiten Flüssig-Flüssig-Extraktion mit demselben Protokoll unterzogen. Alle organischen Phasen wurden vakuumgetrocknet und für die LC-MS/MS-Analyse in 60 μl 50 % MeOH suspendiert.

Qualiquantitative LC-MS/MS-Analysen der Reaktionsmischungen aus verschiedenen Biokonversionsexperimenten wurden auf einem LTQ-Orbitrap ESI-Massenspektrometer (Thermo-Fisher Scientific) in Verbindung mit einem Accela UHPLC-System (Thermo-Fisher Scientific) durchgeführt. Die chromatographische Trennung wurde auf einer Kinetex C18-Säule (150 × 2 mm, 2,6 μm) (Phenomenex) unter Verwendung von wässriger 0,1 % Ameisensäure (A) und Methanol (B) als mobile Phasen durchgeführt, ein linearer Gradient von 5 bis 30 % B in 10 min und einer Durchflussrate von 200 μL/min. Vollmassenspektren (MS1) wurden im hochauflösenden Negativionenmodus über den m/z-Bereich von 125 bis 500 aufgenommen. MS/MS-Spektren wurden für das intensivste in den MS1-Spektren nachgewiesene Ion (abhängiger Scanmodus) von in aufgenommen -Fallenfragmentierung.

Die relative Häufigkeit von 4-OHE2 und Reaktionsprodukten wurde geschätzt, indem für jede Verbindung ein extrahiertes Ionenchromatogramm erstellt wurde (m/z 287,2 für 4-OHE2, 323,2 für 4-OHE2-Meta-Spaltungsprodukt und 305,2 für 4-OHE2-Cyclisierungsprodukt (hypothetisch). .

Für jede Verbindung wurde die höchste registrierte Peakfläche als 100 %-Fläche angenommen. Der Flächenprozentsatz zu den anderen Zeitpunkten wurde im Vergleich zur höchsten Peakfläche berechnet. Die zu den verschiedenen Zeitpunkten erhaltenen relativen Häufigkeiten wurden als Funktion der Zeit aufgetragen.

Die Proben wurden dreifach analysiert und die Daten wurden als Mittelwert der gemessenen Flächen angegeben.

ERCDs-Proteinsequenzen sind in der UniProt-Datenbank verfügbar. Die Zugangsnummern lauten wie folgt: F6IHX1, F6ID78, F6IHP2 und F6IHN4 für die Proteine ​​PP28735, PP26077, PP00124 bzw. PP00193.

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FM und VC konzipierten die Arbeit und führten den Großteil der experimentellen Arbeit durch. FDP und BC führten HPLC- und HPLC-MS/MS-Analysen durch. AB führte Proteinanalysen durch. VC, EN, VI und FDP überarbeiteten Experimente, trugen zur kritischen Dateninterpretation bei und überprüften die Arbeit. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Valeria Cafaro.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 27. Januar 2023

Veröffentlicht: 01. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

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