YiaC und CobB regulieren die Lysin-Laktylierung in Escherichia coli

Jun 18, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6628 (2022) Diesen Artikel zitieren

3484 Zugriffe

3 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Kürzlich wurde berichtet, dass Lysin-Lactylierung (Kla) an der Regulierung der Transkription in menschlichen Zellen beteiligt ist. Die Charakterisierung, der Regulierungsmechanismus und die funktionellen Konsequenzen von Kla in Prokaryoten bleiben jedoch unklar. Hier berichten wir, dass YiaC als Lysin-Lactylase fungiert und dass CobB als Lysin-Delactylase bei der Regulierung des Stoffwechsels fungiert. Wir zeigen, dass YiaC die Zugabe von Kla katalysiert, während CobB dieses PTM sowohl in vitro als auch intrazellulär löscht. Darüber hinaus zeigen wir, dass YdiF die Bildung eines Lactyl-Coenzyms A katalysieren kann, das eine Lactylgruppe für Kla spendet. Die quantitative Proteomanalyse zeigt außerdem 446 endogene Kla-Stellen, auf die CobB abzielt, und 79 Kandidaten, auf die YiaC in Escherichia coli (E. coli) abzielt. Darüber hinaus stellen wir dar, dass Kla die Funktionen von Stoffwechselenzymen beeinflussen kann. Interessanterweise zeigen wir, dass CobB die Aktivität von PykF gezielt modulieren kann, indem es K382la reguliert und so die Glykolyse und das Bakterienwachstum fördert. Unsere Studie identifiziert die regulatorischen Enzyme und das funktionelle Netzwerk von Kla und deckt einen Kla-vermittelten molekularen Mechanismus auf, der durch CobB für die Glykolyseregulierung in E. coli katalysiert wird.

Die posttranslationale Modifikation (PTM) ist ein Schlüsselelement bei der Regulierung von Proteinfunktionen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener Zellfunktionen und des Krankheitsverlaufs in Eukaryoten1,2. Darüber hinaus gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass PTMs auch in Prokaryoten eine wichtige Funktion erfüllen. Beispielsweise reguliert die Lysinacetylierung (Kac) die bakterielle Virulenz3, die Chemotaxis4 und die Stabilität von Proteinen5,6. Wir haben kürzlich herausgefunden, dass die Lysin-2-hydroxyisobutyrylierung (Khib) an der Regulierung des bakteriellen Stoffwechsels, der Transkription und der Antibiotikaresistenz beteiligt ist7,8,9,10. Das Verständnis der Funktion und des Regulierungsmechanismus von PTMs in Prokaryoten ist jedoch weiterhin begrenzt.

Kürzlich wurde berichtet, dass Lysin-Lactylierung (Kla) ein neu identifizierter PTM-Typ auf menschlichen Histonen zur Regulierung der Makrophagenpolarisierung und -zustände ist11,12,13,14. Weitere Studien zeigten, dass Kla auf Histonen die zelluläre Stoffwechselreprogrammierung während der Differenzierung pluripotenter Stammzellen und bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs beeinflussen kann15,16, die Onkogenese vorantreiben kann und über die Regulierung der Gentranskription mit neuronaler Erregung verbunden ist17,18. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Kla am Nichthistonprotein HMGB1 die exosomale Freisetzung bei polymikrobieller Sepsis fördert19. Den Daten zufolge wurde Kla bei Eukaryoten, einschließlich Menschen, Mäusen, Reis und Botrytis cinerea11,18,20,21, nachgewiesen. Es bleibt jedoch unklar, ob Kla in Prokaryoten existiert und welche Rolle diese unentdeckten Kla-Modifikationen spielen könnten.

Es wird angenommen, dass die dynamischen zeitlichen und räumlichen Veränderungen von PTMs wichtige biologische Ereignisse sind, die die Proteinfunktion in verschiedenen zellulären Prozessen modulieren. Reversible PTMs werden normalerweise durch zwei Arten von Enzymen reguliert, die PTMs gezielt hinzufügen oder entfernen. Beispielsweise wurde ausführlich berichtet, dass Lysin-Acetyltransferasen (KATs) und Lysin-Deacetylasen (KDACs) verschiedene Acylierungen oder Deacylierungen katalysieren1,22,23,24. Für Kla fungiert P300 als potenzielle Lactylase und Histondeacetylasen der Klasse I (HDAC1‒3) dienen als Delactylasen11,25. Allerdings sind die regulatorischen Enzyme für Kla in Prokaryoten noch unbekannt.

Hier haben wir das Kla-Proteom in Escherichia coli (E. coli) MG1655 profiliert, den Schreiber und Löscher für Kla identifiziert und die Kla-vermittelte Wirkung auf die bakterielle Glykolyse und das Wachstum veranschaulicht. Wir identifizierten YiaC als Lactylase und CobB als Delactylase, indem wir Stämme mit überexprimierten Proteinen der GCN5-verwandten N-Acetyltransferase (GNAT)-Familie und CobB durchmusterten. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass YiaC und CobB die Addition bzw. Entfernung der Lysin-Lactylierung sowohl in vitro als auch intrazellulär katalysieren können. Als nächstes identifizierten wir durch die Durchführung einer stabilen Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) einen quantitativen Proteomics-Ansatz, 79 endogene Kla-Stellen, die möglicherweise von YiaC reguliert werden, und 446 Kla-Kandidaten, auf die CobB abzielt. Wir identifizierten insgesamt 1047 Kla-Stellen auf 478 Proteinen in E. coli MG1655 und zeigten, dass laktylierte Proteine ​​hauptsächlich mit dem Stoffwechsel zusammenhängen. Wir haben außerdem gezeigt, dass CobB PykF K382la löschen kann, um die Glykolyse zu verbessern und das Wachstum von E. coli zu fördern. Zusammenfassend identifiziert diese Studie das regulatorische Enzymsystem für Kla in Bakterien, profiliert die endogenen Substratproteine ​​von Kla und veranschaulicht den molekularen Mechanismus der Kla-vermittelten Regulierung der Glykolyse.

Kla wurde ursprünglich als Histonmarker in eukaryotischen Zellen identifiziert11,12,13,14. Es blieb jedoch unklar, ob das neuartige PTM in Prokaryoten existierte. Um dieses Ziel zu erreichen, führten wir einen Western-Blot-Assay mit Pan-Kla-Antikörper für Ganzzelllysate von E. coli durch. Wie in der ergänzenden Abbildung 1a gezeigt, wurde eine Reihe von Lysin-lactylierten Proteinen nachgewiesen, was die Existenz von Kla in Prokaryoten bestätigt.

Reversible PTMs, die durch Schreiber und Radierer reguliert werden, modulieren Proteinfunktionen in verschiedenen zellulären Prozessen. Daher ist es unerlässlich, die regulatorischen Enzyme von Kla zu identifizieren, um seine Funktion und seinen Regulierungsmechanismus in Prokaryoten zu verstehen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Acetyltransferasen (KATs) und Deacetylasen verschiedene Lysinacylierungen wie Acetylierung, Succinylierung und Crotonylierung regulieren können24,26,27,28,29,30. Daher haben wir die rationale Hypothese aufgestellt, dass einige KATs und Deacetylasen die Hinzufügung und Entfernung von Kla katalysieren könnten.

GNATs sind die einzige Proteinfamilie, die in E. coli als Lysinacetylasen fungiert31,32. Unsere jüngste Arbeit zeigte, dass TmcA als Lysin-2-Hydroxyisobutyryltransferase dient, indem wir GNAT-überexprimierende E. coli BL21 (λDE3)-Stämme durchmusterten9. Hier verwendeten wir 18 GNAT-überexprimierende E. coli BL21 (λDE3)-Stämme (pGNAT), um Lactylase-Kandidaten durch Immunblotting von Ganzzelllysaten mit einem Pan-Kla-Antikörper zu screenen. Im Vergleich zu E. coli, das den leeren pET28a-Vektor enthielt, stellten wir fest, dass nur die Überexpression von YiaC einen starken und offensichtlichen Anstieg der Kla-Spiegel verursachte (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1b, c), was YiaC als Lysin-Lactylase-Kandidaten identifizierte. Um seine katalytische Aktivität gegenüber Kla zu bestätigen, haben wir außerdem Kla-Spiegel in E. coli MG1655 yiaC+ und ΔyiaC nachgewiesen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass der Kla-Spiegel im ΔyiaC-Stamm signifikant verringert war (Abb. 1b). Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass YiaC ein Laktylase-Kandidat ist, der die Erzeugung von Kla katalysiert.

Eine Überexpression von YiaC erhöhte die Kla-Spiegel in E. coli. E. coli BL21 (λDE3) wurde mit dem leeren Vektor (pET28a) als Kontrolle und mit Vektor-GNAT-Genen-pET28a als GNAT-überexprimierenden Stämmen (pGNAT) übertragen, der Kla-Spiegel von Ganzzelllysaten wurde durch Immunblotting analysiert. b Ein Mangel an YiaC verringerte Kla in E. coli. Der Kla-Spiegel von E. coli MG1655 ΔyiaC wurde durch Immunblotting analysiert, mit yiaC+ als Kontrolle. c Die Überexpression von CobB verringerte die Kla-Spiegel in E. coli. Durch Immunblotting wurden die Kla-Spiegel von E. coli BL21 (λDE3) analysiert, der pET28a als Kontrolle und cobB-pET28a als pCobB-Stamm transferierte. d Ein Mangel an CobB erhöhte Kla in E. coli. Der Kla-Spiegel von E. coli MG1655 ΔcobB wurde durch Immunblotting analysiert, mit cobB+ als Kontrolle. Alle Immunoblots hatten drei biologische Wiederholungen mit ähnlichen Ergebnissen. Und alle Stämme wurden in LB-Medium bei 37 °C kultiviert.

Um die Delactylase für E. coli zu untersuchen, haben wir die Kla-Spiegel des CobB-überexprimierenden Stamms E. coli BL21 (λDE3) (pCobB) analysiert, wobei CobB die wichtigste bekannte Deacylase in E. coli zur Entfernung von Acetylierung, Succinylierung usw. ist 2-Hydroxyisobutterylierung8,33,34,35. Im Vergleich zu E. coli, das den leeren pET28a-Vektor enthielt, verursachte der pCobB-Stamm einen signifikanten Rückgang der Kla-Spiegel (Abb. 1c). Anschließend stellten wir fest, dass die Kla-Werte in E. coli MG1655 ΔcobB im Vergleich zu cobB+ leicht erhöht waren (Abb. 1d). Diese Ergebnisse zeigten, dass CobB als endogene Delactylase fungiert.

Es ist bekannt, dass Acetyl-CoA oder Acetylphosphat als Acetylgruppendonor für die Acetylierung in Prokaryoten fungieren können36. Es gibt jedoch keine Hinweise auf das Vorhandensein von Lactylphosphat in E. coli. Für Lactyl-CoA deutete eine frühere Studie darauf hin, dass frischer E. coli-Proteinextrakt Laktat zu Lactyl-CoA katalysieren kann37,38. Um dies zu bestätigen, haben wir als Kontrolle Lactyl-CoA in Ganzzelllysaten nachgewiesen. Wie erwartet haben wir einen geringen Gehalt an Lactyl-CoA festgestellt (ergänzende Abbildung 2e), was zeigt, dass Lactyl-CoA in E. coli vorhanden ist. Als nächstes inkubierten wir Laktat mit frischen Ganzzelllysaten und stellten fest, dass Laktat effektiv in Lactyl-CoA umgewandelt werden konnte (ergänzende Abbildung 2e).

Um die Bildung von Lactyl-CoA besser zu verstehen, haben wir die mögliche Synthetase oder Transferase von Lactyl-CoA untersucht. Zunächst wählten wir Acetyl-CoA-Synthetase (Acs) und Propionat-CoA-Synthetase (PrpE) als Kandidaten für Lactyl-CoA-Synthetase in E. coli aus. Um zu untersuchen, ob Acs oder PrpE Laktat zu Lactyl-CoA katalysieren können, inkubierten wir gereinigtes Acs mit Acetat oder Laktat und PrpE mit Propionat bzw. Laktat. Wir beobachteten jedoch, dass weder Acs noch PrpE die Bildung von Lactyl-CoA aus Lactat katalysieren konnten (Ergänzende Abbildungen 2c, d, f, g). Kürzlich wurde berichtet, dass fünf CoA-Transferasen aus verschiedenen Arten, darunter Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Megasphaera sp. DISK 18, Clostridium lactatifermentans An75 und das Firmicutes-Bakterium CAG:466 können Laktat in Lactyl-CoA umwandeln39,40. Nach einer BLAST-Suche stellten wir fest, dass die Acetat-CoA-Transferase (Ydif) in E. coli bei den fünf Transferasen eine hohe Sequenzkonservierung aufweist, insbesondere in den Motiven EXGXXG und GXGGF (ergänzende Abbildung 2a, b). Daher inkubierten wir gereinigtes YdiF mit Acetat oder Lactat. Interessanterweise fanden wir heraus, dass YdiF die Umwandlung von Acetyl-CoA oder Lactyl-CoA aus Acetat oder Lactat in vitro katalysieren kann (Abb. 2a, b), was darauf hindeutet, dass Ydif Lactyl-CoA-Transferase-Aktivität aufweist. Um seine intrazelluläre katalytische Aktivität zu bestätigen, haben wir die Kac- und Kla-Spiegel im YdiF-überexprimierenden E. coli BL21 (λDE3)-Stamm (pYdiF) weiter analysiert. Im Vergleich zu E. coli, das den leeren pET28a-Vektor enthielt, stellten wir fest, dass der pYdiF-Stamm einen signifikanten Anstieg der Kac- und Kla-Spiegel verursachte (Abb. 2c). Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Lactyl-CoA in E. coli existiert und dass YdiF als Lactyl-CoA-Transferase für die Umwandlung von Lactyl-CoA aus Lactat dienen kann.

a wird durch YdiF zur Herstellung von Acetyl-CoA (Ac-CoA) durchgeführt. − YdiF: Inkubationsacetat mit Acetoacetyl-CoA (Acac-CoA), + YdiF: Inkubationsacetat mit Acetoacetyl-CoA (Acac-CoA) mit YdiF. n = 3 biologische Wiederholungen. b wird durchgeführt, um Lactyl-CoA (la-CoA) durch YdiF zu produzieren. − YdiF: Inkubationslactat mit Acetoacetyl-CoA (Acac-CoA), + YdiF: Inkubationslactat mit Acetoacetyl-CoA (Acac-CoA) mit YdiF. n = 3 biologische Wiederholungen. c YdiF-Überexpression erhöhte die Bildung von Acetyl-CoA und Lactyl-CoA. Durch Immunblotting wurden Kac und Kla von E. coli BL21 (λDE3) analysiert, wobei pET28a als Kontrolle und ydiF-pET28a als pYdiF-Stamm übertragen wurden. d ITC-Analyse der Affinität von rekombinantem YiaC mit Lactyl-CoA, Acetyl-CoA und Succinyl-CoA, drei biologische Wiederholungen, mit ähnlichen Ergebnissen. e YiaC katalysierte die Acetylierung, jedoch nicht die Succinylierung. Durch Immunblotting wurden Kac und Ksucc von E. coli BL21 (λDE3) analysiert, der pET28a als Kontrolle und yiaC-pET28a als pYiaC-Stamm übertrug. f ITC-Analyse der Affinität von rekombinantem CobB mit Kla-Peptid (AETAEK(la)YGDEQVK) und Kac-Peptid (AETAEK(ac)YGDEQVK), drei biologische Wiederholungen, mit ähnlichen Ergebnissen. g CobB katalysierte die Delactylierung von Peptiden in vitro. Synthetische Peptide (AETAEK(la)YGDEQVK, AETAEK(ac)YGDEQVK) wurden als Substrate für die CobB-Reaktion mit LC-MS-Nachweis der Lysin-Delactylierungs- und Deacetylierungsaktivitäten von CobB, drei biologische Wiederholungen, mit ähnlichen Ergebnissen verwendet. h YiaC katalysierte die Laktylierung von Peptiden in vitro. Synthetisches Peptid (TICHDKAFVR) wurde als Substrat für die YiaC-Reaktion mit LC-MS-Nachweis der Lysin-Lactylierungs- und Acetylierungsaktivitäten von YiaC verwendet, drei biologische Wiederholungen, mit ähnlichen Ergebnissen. i Kinetische Parameter (kcat, Km und kcat/Km) von YiaC für Lactylaiton und CobB für Delactylierung, n = 3 biologische Wiederholungen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Tests, zweiseitiger Student-T-Test. P-Werte sind in der Abbildung angegeben. Alle Immunoblots hatten drei biologische Wiederholungen mit ähnlichen Ergebnissen. Alle Stämme wurden in LB-Medium bei 37 °C kultiviert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Frühere Studien zeigten, dass Lysinacylasen normalerweise an relevantes Acyl-CoA binden, um die katalytische Funktion zu starten22,41, während Deacylasen das entsprechende modifizierte Lysin erkennen müssen, um die Entfernung des PTM8 zu katalysieren. Daher führten wir einen isothermen Titrationskalorimetrietest (ITC) durch, um die Bindung von YiaC an Lactyl-CoA und CobB an laktyliertes Peptid nachzuweisen. Da es sich bei YiaC um eine bekannte Lysinacetylase und bei CobB um eine Deacetylase32,33 handelt, verwendeten wir separat Acetyl-CoA und acetyliertes Peptid als Kontrollen. Wie erwartet gab es eine starke Bindung zwischen YiaC und Lactyl-CoA (KD = 6,83 μM), die der von Acetyl-CoA (KD = 5,57 μM) ähnelte; Stattdessen gab es keine Bindung zwischen YiaC und Succinyl-CoA (Abb. 2d, Ergänzende Daten 1). Als nächstes stellten wir fest, dass die Überexpression von YiaC Kac wie berichtet hochregulieren konnte32, jedoch im Vergleich zu mit dem pET28a-Vektor transformierten E. coli keine Veränderung der Succinylierung verursachte (Abb. 2e), was mit den ITC-Ergebnissen übereinstimmte. Diese Ergebnisse liefern einen weiteren unterstützenden Beweis dafür, dass YiaC die Zugabe von Kla katalysieren kann. Wir haben auch die Bindung von CobB mit laktyliertem Peptid (AETAEK(la)YGDEQVK, aus GpmA) und acetyliertem Peptid (AETAEK(ac)YGDEQVK, aus GpmA) nachgewiesen. Die ITC-Ergebnisse zeigten, dass CobB an laktyliertes Peptid (KD = 0,371 μM) binden konnte, ähnlich wie acetyliertes Peptid (KD = 0,508 μM) (Abb. 2f, Ergänzende Daten 1).

Um die enzymatischen Aktivitäten von YiaC und CobB zu charakterisieren, führten wir außerdem in vitro Enzymreaktionstests mit synthetischen Peptiden durch. Zur Überwachung von Kla und Kac der umgesetzten Peptide wurde Flüssigkeitschromatographie-MS (LC-MS) eingesetzt, und das MS/MS-Spektrum wurde verwendet, um deren Richtigkeit zu überprüfen. Durch Inkubation von CobB mit laktyliertem oder acetyliertem Peptid (AETAEK(la oder ac)YGDEQVK, von GpmA) fanden wir heraus, dass CobB die Hydrolyse des Lactylpeptids in Gegenwart von NAD+ (Nicotinamidadenindinukleotid) effizient katalysierte. Im Gegensatz dazu wurde das delactylierte Peptid in der Reaktion ohne NAD+ nicht nachgewiesen, was auf einen NAD-abhängigen Delactylierungsmechanismus, ähnlich der Deacetylierung, schließen lässt (Abb. 2g). Anschließend stellten wir fest, dass die Delactylierungsreaktion durch Nicotinamid (NAM) (ein HDAC-Inhibitor der Klasse III) gehemmt werden konnte und dass NAM bei der Deacetylierung wirksamer war als bei der Delactylierung (Abb. 2g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NAD-abhängiges CobB die Lysin-Delactylierung in vitro katalysieren kann, die durch NAM effizient gehemmt werden kann. Darüber hinaus haben wir durch Inkubation von YiaC mit einem Peptid (TICHDKAFVR), das Lactyl-CoA oder Acetyl-CoA präsentiert, herausgefunden, dass YiaC die Lactylierung in vitro katalysieren kann. Im Vergleich zur Acetylierung ist YiaC wahrscheinlich effizienter für die Laktylierung (Abb. 2h).

Um die enzymatische Kinetik von YiaC und CobB zu bestimmen, verwendeten wir als nächstes einen Matrix-unterstützten Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-MS-Assay (MALDI-TOF), um die kinetischen Parameter (kcat, Km und kcat/Km) von zu berechnen YiaC für die Laktylierung und CobB für die Delaktylierung. Die kinetischen Messungen (Abb. 2i, ergänzende Abb. 3, ergänzende Daten 2) bestätigten die Lactylaseaktivität von YiaC (kcat = 0,97 ± 0,03 s−1, Km = 26,6 ± 1,1 μM, kcat /Km = 3,6 × 104 s−1). .M−1) ist wirksamer als Acetylase (kcat = 0,23 ± 0,04 s−1, Km = 28,7 ± 1,2 μM, kcat /Km = 8,0 × 103 s−1.M−1). Die Delactylaseaktivität von CobB (kcat = 0,99 ± 0,04 s−1, Km = 25,4 ± 1,5 μM, kcat /Km = 3,9 × 104 s−1.M−1) ähnelt der Deacetylaseaktivität (kcat = 0,97 ± 0,02 s). −1, Km = 18,7 ± 1,0 μM, kcat /Km = 5,2 × 104 s−1.M−1). Diese Ergebnisse zeigen die enzymatische kinetische Charakterisierung von YiaC für die Laktylierung und CobB für die Delaktylierung.

Um die durch YiaC und CobB regulierten endogenen Kla-Substrate zu verstehen, führten wir quantitative Proteomik durch, indem wir SILAC und Affinitätsanreicherung kombinierten, um den Einfluss der YiaC- oder CobB-Gendeletion auf das Lactylom in E. coli zu analysieren (Abb. 3a). Beim Vergleich der Stämme E. coli MG1655 yiaC+ und ΔyiaC haben wir 451 Kla-Stellen in 247 Proteinen quantifiziert (Supplementary Data 3). Indem wir die nachgewiesenen Häufigkeiten auf die Expression ihrer entsprechenden Proteine ​​normalisierten (ergänzende Abbildung 4a), quantifizierten wir 79 signifikant herunterregulierte Kla-Stellen (mehr als 1,5-fache Reduktion) in E. coli ΔyiaC (Abbildung 3b). Bei diesen herunterregulierten Kla handelt es sich möglicherweise um potenziell funktionelle, auf YiaC ausgerichtete Substrate. Darüber hinaus haben wir beim Vergleich der Stämme E. coli MG1655 cobB+ und ΔcobB 818 Kla-Stellen in 375 Proteinen quantifiziert (Supplementary Data 4). Normalisiert durch die Häufigkeit der entsprechenden Proteine ​​(ergänzende Abbildung 4b) zeigte das Ergebnis, dass mehr als die Hälfte der Kla-Stellen im ΔcobB-Stamm im Vergleich zum cobB+-Stamm signifikant hochreguliert waren (mehr als ein 1,5-facher Anstieg) (Abb. 3c). . Insgesamt 446 hochregulierte Kla-Standorte waren mögliche CobB-Zielsubstrate. Durch den Vergleich der von YiaC und CobB anvisierten Kandidaten stellten wir fest, dass 63 % der von YiaC laktylierten Proteine ​​auch Substrate für CobB waren (ergänzende Abbildung 4c), während nur 29 Kla-Stellen auf 25 Proteinen durch diese beiden Enzyme deutlich koreguliert wurden (ergänzende Abbildung). 4d), was darauf hinweist, dass das aus YiaC und CobB bestehende Kla-Regulationssystem möglicherweise nicht das einzige ist und es wahrscheinlich ist, dass es andere intrazelluläre regulatorische Enzyme gibt. Darüber hinaus analysierten wir die Sequenzeigenschaften von Kla-Peptiden, die möglicherweise durch YiaC und CobB reguliert werden. Wie in Abb. 3d gezeigt, umgaben saures Glutamat und Aspartat sowie hydrophobes Valin eindeutig Kla, das sich in YiaC-zielgerichteten Kla-Peptiden befand. Darüber hinaus umgaben saures Glutamat, hydrophobes Alanin und basisches Lysin Kla, das sich in auf CobB gerichteten Kla-Peptiden befindet (Abb. 3e). Der Unterschied in den Sequenzeigenschaften deutete darauf hin, dass YiaC und CobB dazu neigen, Kla in unterschiedlichen charakteristischen Aminosäuresequenzen zu katalysieren. Dies erklärt in gewisser Weise auch, warum nur eine kleine Anzahl gemeinsam regulierter Standorte identifiziert wurde. Um die biologische Bedeutung der YiaC- und CobB-Regulation zu verstehen, führten wir außerdem eine Gen-Ontologie-Analyse (GO) von Kla-Proteinkandidaten durch, auf die YiaC oder CobB abzielen. Wir fanden heraus, dass Kla-Kandidaten für YiaC oder CobB hauptsächlich mit dem Stoffwechsel und der Biosynthese, insbesondere der Glykolyse, zusammenhängen und hauptsächlich im Ribosom und im Zytosol mit Diversitätsbindungsaktivitäten vorkommen (Abb. 3f, g), was darauf hindeutet, dass Kla durch YiaC und CobB reguliert wird kann den Stoffwechsel und die Biosynthese beeinflussen.

a Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs zur SILAC-Quantifizierung. b Streudiagramm, das das Verhältnis von Kla-Peptiden in E. coli MG1655 yiaC+ zu ΔyiaC zeigt (normalisiert durch Proteinhäufigkeit). c Streudiagramm, das das Verhältnis von Kla-Peptiden in E. coli MG1655 cobB+ zu ΔcobB zeigt (normalisiert durch Proteinhäufigkeit). d Das Logo des Sequenzmotivs zeigt eine repräsentative Sequenz für YiaC-regulierte Kla-Standorte. Das Logo des Sequenzmotivs zeigt eine repräsentative Sequenz für CobB-regulierte Kla-Standorte. f GO-Analyse für Kla-Proteinkandidaten, auf die YiaC abzielt. g GO-Analyse für Kla-Proteinkandidaten, auf die CobB abzielt. Als Cutoff-Kriterien wurden der p-Wert-Cutoff = 0,05 und der q-Wert-Cutoff = 0,2 gewählt. Zur Anpassung der P-Werte wurde eine Benjamini- und Hochberg-Korrektur verwendet.

Die biologischen Eigenschaften von Kla in Prokaryoten blieben unklar, daher haben wir die beiden in den Zusatzdaten 3 und 4 aufgeführten Gruppen quantifizierter Laktylomdaten kombiniert und alle identifizierten Kla-Daten in Wildtyp-E. coli MG1655 als Laktylom in E. coli ausgewählt. Wir haben insgesamt 1047 Kla-Stellen in 478 Proteinen identifiziert (Abb. 4a, Ergänzungsdaten 5). Bei der Analyse der Häufigkeit von Kla in Proteinen stellten wir fest, dass die meisten identifizierten Proteine ​​(~57 %) 1–2 Kla-Stellen haben und 11 % der Proteine ​​mehr als 5 Kla-Stellen haben. Interessanterweise sind viele Proteine, die reich an Kla-Stellen sind, Stoffwechsel- und Biosyntheseenzyme (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass Kla funktionelle Auswirkungen auf den Stoffwechsel und die Biosynthese von Bakterien haben kann. Bei der Analyse der Sequenzeigenschaften von Kla-Peptiden stellten wir fest, dass saures Glutamat und basisches Lysin mit hoher Sicherheit von Kla umgeben waren (ergänzende Abbildung 5a). Darüber hinaus zeigte die GO-Analyse dieses Laktyloms, dass laktylierte Proteine ​​hauptsächlich mit Metabolismus, Translation, Ribosomenassemblierung und Biosynthese zusammenhängen und hauptsächlich in Ribosomen mit unterschiedlichen Bindungsaktivitäten vorkommen (ergänzende Abbildung 5b). Um die Wahrscheinlichkeit von Kla relativ zu seinem Substrat zu analysieren, verwendeten wir die Intensität von Kla, die in Wildtyp-E. coli MG1655 identifiziert wurde, dividiert durch die Intensität des entsprechenden Proteins. Wir haben ein Verhältnis > 0,001 als Kla-Stellen mit hoher Häufigkeit auf den Proteinen definiert (Supplementary Data 6); Somit wurden insgesamt 323 Kla-Stellen auf 240 Proteinen als mit hoher Häufigkeit vorkommend definiert (ergänzende Abbildung 5c, d). Die GO-Analyse zeigte, dass diese Proteine ​​​​mit hoher Kla-Frequenz größtenteils auch mit verschiedenen Stoffwechselwegen zusammenhängen (ergänzende Abbildung 5e). Insbesondere ergab eine weitere Analyse laktylierter Proteine ​​in Stoffwechselwegen, dass fast alle Enzyme in der Glykolyse, im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und in der Fettsäurebiosynthese laktyliert sind; Darüber hinaus wurden die meisten dieser Enzyme auch als Kandidaten für die CobB- oder YiaC-Regulation identifiziert (Abb. 4c). Es wurde auch gezeigt, dass CobB über einen größeren regulatorischen Bereich als YiaC verfügt und dass sie dasselbe Protein gemeinsam regulieren können und über ihre eigenen spezifischen regulatorischen Proteine ​​verfügen.

a Statistische Analyse der Kla-Proteine ​​und -Standorte von E. coli. b Die Häufigkeit von Kla tritt auf Proteinen auf. c Die laktylierten Enzyme im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel und Fettsäurebiosynthesenetzwerk in E. coli.

Um die durch YiaC und CobB regulierte Funktion von Kla zu untersuchen, führten wir In-vitro-Experimente durch. Gemäß den Kla-Netzwerken (Abb. 3b, c) führten wir außerdem eine Gruppe von In-vitro-Reaktionen durch, bei denen YiaC und CobB mit ihren jeweiligen Kandidatenproteinen inkubiert wurden. Anschließend wurden die Kla-Spiegel der Kandidatenproteine ​​durch Immunblotting nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass YiaC Citrat-Synthase (GltA) und Nikotinat-Phosphoribosyltransferase (PncB) effektiv laktylieren kann (Abb. 5a, b), während CobB Pyruvatkinase I (PykF) und 2,3-Bisphosphoglycerat-abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA) eindeutig delaktylieren kann. und Malatdehydrogenase (Mdh) in vitro (Abb. 5c – e). Somit ist ersichtlich, dass YiaC und CobB die Kla-Spiegel verschiedener Stoffwechsel- und Biosyntheseenzyme regulieren können; Insbesondere kann CobB Glykolyseenzyme in vitro weitgehend delactylieren, was mit den Ergebnissen der GO-Analyse in Abb. 3g übereinstimmt.

a, b YiaC kann Kla von GltA und PncB in vitro spezifisch katalysieren. Rekombinantes GltA oder PncB wurde mit YiaC in Gegenwart von Lactyl-CoA (1 mM) 10 Stunden lang bei 25 °C inkubiert und ein Immunoblot durchgeführt. c–e CobB kann Kla von GpmA, Mdh und PykF in vitro spezifisch löschen. Rekombinantes GpmA, Mdh oder PykF wurde mit CobB 10 Stunden lang bei 25 °C inkubiert und ein Immunoblot durchgeführt. f Die Liste der identifizierten Kla-Stellen von Enzymen. g–i Nachweis der Aktivitäten von Enzymen und ihren Mutanten (K bis Q und K bis R) (Daten sind Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Tests, zweiseitiger Student-t-Test). Alle Immunoblots hatten drei biologische Wiederholungen mit ähnlichen Ergebnissen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um festzustellen, ob Kla die enzymatische Aktivität beeinflussen kann. Zuerst haben wir die Kla-Stellen dieser durch YiaC und CobB regulierten Proteine ​​anhand der Zusatzdaten 3 und 4 bestätigt (Abb. 5f) und dann haben wir laktyliertes K durch Q (Glutamin) ersetzt, da die elektrische Eigenschaft von Kla ähnlich neutral ist von Glutamin und ersetzte unmodifiziertes K durch R (Arginin), da die positive Ladung von K der von R ähnelt. Durch die Kombination der enzymatischen Aktivitätstests in vitro stellten wir fest, dass die enzymatischen Aktivitäten der Simulation der Kla-Varianten PncBK381Q, GpmAK106Q und PykFK382Q waren im Vergleich zu denen der Wildtyp-Proteine ​​deutlich verringert. Die enzymatischen Aktivitäten der unmodifizierten Mutanten PncBK381R, GpmAK106R und PykFK382R waren erhöht (Abb. 5g – i). Diese Ergebnisse legen nahe, dass YiaC und CobB Kla vermitteln können, um die Aktivitäten von Stoffwechselenzymen zu beeinflussen.

Vor allem Stoffwechsel- und Synthesewege beeinflussen das Bakterienwachstum42,43,44. Daher haben wir rational vorhergesagt, dass die durch Kla verursachten Veränderungen der PncB-, GpmA- und PykF-Aktivitäten das Bakterienwachstum beeinflussen könnten. Um diese Hypothese zu bestätigen, haben wir zunächst die Zuverlässigkeit der identifizierten Kla-Peptide bestätigt, indem wir drei Arten von Kla-Peptiden aus dem YiaC-bezogenen Proteom und drei Arten von Kla-Peptiden aus dem CobB-bezogenen Proteom synthetisierten, die die Peptide PncB K381la (TICHDK(la)) enthielten. AFVR), GpmA K106la (AETAEK(la)YGDEQVK) und PykK382la (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR). Wie in Abb. 6a, b und der ergänzenden Abb. 6 gezeigt, überlappen die gesamten MS/MS-Spektren synthetischer Kla-Peptide fast vollständig mit intrazellulär modifizierten Peptiden; Daher wurde die Zuverlässigkeit der Kla-Peptide bestätigt. Als nächstes konstruierten wir separat PykF, PykFK382Q und PykFK382R, die E. coli MG1655 (pPykF-, pPykFK382Q- und pPykFK382R-Stämme) überexprimieren, und wir konstruierten die pPncB-, pPncBK381Q-, pPncBK381R-, pGpmA- und pGpmAK106Q- und pGpmAK106R-Stämme. Anschließend wurden die Wachstumskurven nach der Kultivierung im Lysogeny-Bouillon-Medium (LB) erfasst. Wir fanden heraus, dass pPncB, pGpmA und ihre mutierten Stämme keinen Unterschied im Wachstum zeigten (ergänzende Abbildung 7a, b). In der PykF-Gruppe wuchs jedoch der Stamm pPykFK382R am schnellsten, während der Stamm pPykFK382Q unter den drei Stämmen mit den gleichen Überexpressionsgraden am langsamsten wuchs (Abb. 6c, d). Darüber hinaus konnten wir intrazelluläre PykF-Aktivität nachweisen. In Übereinstimmung mit den Wachstumskurven zeigte der Stamm pPykFK382R die höchste Aktivität und pPykFK382Q die niedrigste Aktivität unter den drei Stämmen (Abb. 6e). Wie berichtet, ist PykF ein entscheidendes geschwindigkeitsbestimmendes Enzym bei der Glykolyse, das den Stoffwechselfluss steuert und die Zellteilung von Bakterien beeinflusst45. Diese Ergebnisse zeigen, dass PykF K382la das Bakterienwachstum verlangsamt, indem es die PykF-Aktivität reduziert. Um diese Beobachtung weiter zu bestätigen und zu berücksichtigen, dass Phosphoenolpyruvat, das durch Glucose-Glykolyse hergestellt wird, unter der Katalyse von PykF46,47 Pyruvat produzieren kann, haben wir M9-Minimalmedium mit 1 % Glucose ausgewählt, damit PykF seine normale Stoffwechselfunktion erfüllen kann, und M9-Minimalmedium mit 1 % Pyruvat ausgewählt um die Funktion von PykF zu blockieren. Anschließend haben wir die Wachstumskurven und die intrazelluläre PykF-Aktivität dieser drei Stämme in M9-Minimalmedium mit 1 % Glucose gemessen, wie in LB. Der Stamm pPykFK382R wuchs am schnellsten und zeigte die höchste PykF-Aktivität, und der Stamm pPykFK382Q wuchs am langsamsten und zeigte die niedrigste PykF-Aktivität (Abb. 6f, g). Um den Einfluss von PykF zu blockieren, haben wir umgekehrt die Wachstumskurven und die intrazelluläre PykF-Aktivität dieser drei Stämme gemessen, die in M9-Minimalmedium mit 1 % Pyruvat kultiviert wurden. Wir fanden heraus, dass es keinen Unterschied im Wachstum der drei Stämme gab (Abb. 6h). Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass PykF K382la das Bakterienwachstum beeinflusst, indem es die PykF-Aktivität verringert.

a Das MS/MS-Spektrum des Peptids (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR, PYKF) aus dem Proteom von ΔcobB. b Das MS/MS-Spektrum des synthetischen Peptids (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR). c Selektion der gleichen Expression von rekombinantem PykF für überexprimierende Stämme durch Immunblotting mit seinem Tag-Antikörper. d Messwachstumskurve von PykF-überexprimierenden E. coli-Stämmen (pPykF, pPykFK382Q und pPykFK382R), kultiviert in LB-Medium bei 37 °C mit 96-Well-Platten. e Messung der intrazellulären Aktivität von PykF von Stämmen im Zusammenhang mit d. f Messung der Wachstumskurve der Stämme pPykF, pPykFK382Q und pPykFK382R, kultiviert in M9-Medium mit 1 % Glucose bei 37 °C mit 96-Well-Platten. g Messung der intrazellulären Aktivität von PykF von mit f verwandten Stämmen. h Messung der Wachstumskurve der Stämme pPykF, pPykFK382Q und pPykFK382R, kultiviert in M9-Medium mit 1 % Pyruvat bei 37 °C mit 96-Well-Platten. i CobB katalysierte die Delaktylierung von PykF K382la in vitro. Das synthetische PykF-K382la-Peptid (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR) wurde als Substrat für die CobB-Reaktion mit LC-MS-Nachweis der Lysin-Delactylierungsaktivität von CobB verwendet. j, k CobB-Regulation der PykF-Aktivität durch Löschen von K382la in vitro. PYKF wurde mit CobB inkubiert, um K382la (j) zu verringern. Nach der Delaktylierung wurde die Aktivität von PykF (k) nachgewiesen. l Messung der Wachstumskurve der E. coli MG1655 cobB+- und ΔcobB-Stämme, kultiviert in M9-Medium mit 1 % Glucose bei 37 °C mit 96-Well-Platten. m Messung der intrazellulären Aktivität von PykF von mit l verwandten Stämmen. n Messwachstumskurve der E. coli MG1655 cobB+- und ΔcobB-Stämme, kultiviert in M9-Medium mit 1 % Pyruvat bei 37 °C mit 96-Well-Platten. o 3D-Analyse des MD-Simulationsergebnisses des PykF-FBP-Systems. p 3D-Analyse des MD-Simulationsergebnisses des PykF K382la-FBP-Systems. Zur Messung der PykF-Aktivität und der Wachstumskurve, n = 3 biologische Replikate, Daten sind Mittelwerte ± SEM, zweiseitiger Student-t-Test, P-Werte sind in der Abbildung angegeben, NS bedeutet nicht signifikant. OD600, optische Dichte bei 600 nm. Immunoblots hatten drei biologische Wiederholungen mit ähnlichen Ergebnissen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Lactylom zeigte, dass CobB PykF K382la intrazellulär delactylierte (Abb. 5f). Um dieses Ergebnis zu bestätigen, inkubierten wir das PykF K382la-Peptid (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR) mit CobB und detektierten die Produkte durch LC-MS/MS. Die Ergebnisse zeigten, dass CobB die Delaktylierung von PykF K382la in vitro effektiv katalysieren kann (Abb. 6i). ). Daher haben wir PykF mit CobB inkubiert, um PykF K382la zu löschen (Abb. 6j) und dann die Aktivität nachgewiesen. Das Ergebnis zeigte, dass die Löschung von PykF K382la durch CobB die PykF-Aktivität in vitro steigerte (Abb. 6k). Für intrazelluläre Tests haben wir die Wachstumskurven und die intrazelluläre PykF-Aktivität von cobB+- und ΔcobB-Stämmen gemessen, die in M9-Minimalmedium mit 1 % Glucose oder 1 % Pyruvat kultiviert wurden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der cobB + -Stamm in M9-Minimalmedium mit 1 % Glucose schneller wuchs als der ΔcobB-Stamm (Abb. 6l). Darüber hinaus war die intrazelluläre PykF-Aktivität von cobB + höher als die des ΔcobB-Stamms (Abb. 6m). Wie erwartet gab es keinen Unterschied im Wachstum der cobB+- und ΔcobB-Stämme (Abb. 6n). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass CobB die PykF-Aktivität regulieren und das Bakterienwachstum beeinflussen kann, indem es PykF K382la in vitro und intrazellulär löscht.

Frühere Studien zeigten, dass Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) an PykF binden und PykF allosterisch aktivieren kann, und dass K382 eine wichtige ortsbezogene allosterische Regulation von PykF darstellt48,49,50. Daher vermuteten wir, dass die Abnahme der PykF-Aktivität durch K382la auf den Einfluss auf die allosterische Aktivierung zurückzuführen sein könnte. Um dies zu bestätigen, führten wir außerdem dreimal 100-ns-Molekulardynamiksimulationen (MD) für PykF-FBP und PykF K382la-FBP durch. Um die dynamische Stabilität der beiden Systemkomplexe zu beobachten, wurden die quadratischen Mittelwertabweichungen (RMSDs) von der Ausgangsstruktur überwacht. Wir haben festgestellt, dass die durchschnittlichen RMSDs dieser beiden Systemkomplexe leicht schwanken (ergänzende Abbildung 8a), was darauf hindeutet, dass beide Systeme stabil sind. Um den Einfluss auf die Bindung besser zu verstehen, haben wir die durchschnittlichen Abstände zwischen dem Stickstoffatom der K382-Seitenkette und dem zentralen Kohlenstoffatom von FBP sowohl im PykF-FBP-System als auch im PykF K382la-FBP-System von 45 ns bis 100 ns gemessen ( Ergänzende Abbildung 8b). Wir fanden heraus, dass der durchschnittliche dreifache Abstand zwischen K382 und FBP im PykF-FBP-System sehr stabil ist, der Abstand zwischen K382la und FBP im PykF-K382la-FBP-System jedoch erhebliche Schwankungen aufweist. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass PykF K382la die Bindung zwischen FBP und PykF beeinflussen kann. Um die Veränderungen in der Mikrostruktur zu beobachten, haben wir die anfängliche und stabile Struktur (0 und 55 ns) mithilfe des GROMACS in zwei Simulationsprozessen ausgewählt. Für das PykF-FBP-System können wir sehen, dass der Abstand von K382 und FBP in der Ausgangsstruktur 9,4 Å beträgt und in der stabilen Struktur nur 8,4 Å (Abb. 6o). Für das PykF K382la-FBP-System beträgt der Abstand von K382la und FBP in der Ausgangsstruktur 10,7 Å, während der Abstand in der stabilen Struktur 15,8 Å beträgt (Abb. 6p). Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass PykF K382la die Bindung zwischen FBP und PykF behinderte und die allosterische Aktivierung von PykF weiter schwächte, was schließlich die Aktivität von PykF verringerte.

Laktat, das früher als Stoffwechselabfall galt, gilt mittlerweile als wichtiger Metabolit bei Säugetieren. Laktat fungiert als wichtiger zirkulierender Kohlenhydratbrennstoff, indem es Drei-Kohlenstoff-Verbindungen bereitstellt51 und die zelluläre Mikroumgebung moduliert, um die Tumorentwicklung und die Immunantwort zu regulieren52,53. Die Entdeckung der Lysin-Laktylierung eröffnete den Horizont der funktionellen Regulierung durch Laktat, und Kla auf Histonen diente als wichtiger Marker zur Regulierung der Transkription in Eukaryoten11,15,17. All diese Beweise zeigten die Bedeutung von Kla. Für Bakterien wurde Laktat zunächst als universeller Sekundärmetabolit identifiziert, und die bakterielle Fermentation ist die wichtigste Methode zur industriellen Produktion von Laktat54. Laktat dient als wichtige Kohlenstoffquelle für den bakteriellen Stoffwechsel55, und die mikrobielle Laktatverwertung kann Stressresistenz, Zellwandumbau und Virulenzfaktoren modulieren56. Darüber hinaus sind mikrobielle Metaboliten des Wirts ein entscheidender Faktor, der viele physiologische Prozesse und die Entwicklung von Krankheiten beeinflusst57, bei denen Laktat die Mikroumgebung stören und eine Immunantwort auslösen kann56,58. Ob Kla in Prokaryoten vorkommt und welche biologischen Funktionen es erfüllen könnte, bleibt unklar. Daher ist es notwendig, die Charakterisierung, Funktionen und Regulationsmechanismen von Kla in Bakterien zu untersuchen.

Unsere Studie zeigt, dass Kla in bakteriellen Proteinen weit verbreitet ist. Wichtig ist, dass wir ein Paar katalytischer Kla-Enzyme identifiziert haben, bei denen CobB als Delactylase fungiert, während YiaC als Lactylase fungiert (Abb. 7). Mithilfe der thermodynamischen Bindungskonstante und der Enzymkinetik haben wir die katalytischen Fähigkeiten von CobB und YiaC charakterisiert und außerdem bewiesen, dass der Regulierungsmechanismus der Delaktylierung durch CobB von NAD und die Laktylierung durch YiaC von La-CoA abhängt. Für die Erzeugung von Kla haben wir das Vorhandensein von Lactyl-CoA als Donor für Kla in E. coli nachgewiesen und festgestellt, dass frische Ganzzelllysate eine katalytische Aktivität für die Umwandlung von Laktat in Lactyl-CoA aufweisen (ergänzende Abbildung 2e). Darüber hinaus haben wir YdiF als Transferase für die Produktion von Lactyl-CoA in E. coli identifiziert (Abb. 2a – c).

YiaC und CobB regulierten Kla in E. coli und beeinflussen das Bakterienwachstum durch Regulierung der PykF-Aktivität.

Um die endogenen regulatorischen Netzwerke zu verstehen, führten wir quantitative Proteomik durch und identifizierten 79 Kla-Kandidatenstellen, die von YiaC reguliert werden, und 446 Kla-Kandidatenstellen, auf die CobB abzielt. Es ist erwähnenswert, dass YiaC und P300 zu unterschiedlichen Proteinfamilien gehören, während letzteres in menschlichen Zellen Lactylase-Aktivität aufweist11 und CobB eine Delactylase ist, die sich auch von HDAC1-3 unterscheidet, die in Eukaryoten als Delactylasen dienen25. Dieser Befund weist darauf hin, dass es in Eukaryoten möglicherweise noch weitere Lactylasen und Delactylasen gibt. Darüber hinaus wurde zuvor über YiaC als Lysin- und N-terminale Acetylase berichtet59,60 und über CobB wurde über Lysinacetylase, Succinylae und 2-Hydroxyisobutyryltransferase berichtet8,33,34. Daher haben wir das Verständnis der regulatorischen und funktionellen Diversität von Acylierungsenzymen erweitert. Die Lysinacylierung ist dosisabhängig vom Metabolismus von Acyl-CoA und den entsprechenden organischen Säuren61,62, und Veränderungen im Metabolismus können regulatorische Enzyme mobilisieren, um die Acylierungsniveaus zu regulieren. Laktat reichert sich in E. coli während der Glucose-Fermentation an63, und der erhöhte Laktatspiegel kann YiaC und CobB mobilisieren, um das Kla-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten.

Hier berichten wir über eine globale Analyse der Lysin-Lactylome in Bakterien. Insgesamt wurden 1047 Kla-Stellen in 478 Proteinen in E. coli identifiziert. Diese Modifikation ist weit verbreitet, ist jedoch hauptsächlich an Stoffwechselenzymen angereichert. Wie in Abb. 4c gezeigt, sind fast alle Enzyme bei der Glykolyse und TCA laktyliert; Bemerkenswert ist, dass diese Enzyme auch als Kandidaten für CobB identifiziert wurden, was darauf hindeutet, dass CobB Kla löschen könnte, um die Aktivitäten von Stoffwechselenzymen zu regulieren. Tatsächlich zeigen unsere Ergebnisse, dass CobB und YiaC Kla vermitteln können, um Auswirkungen auf ihre Substrate auszuüben. Beispielsweise reguliert CobB K106la von GpmA und K382la von PykF herunter, um die Aktivitäten der entsprechenden Enzyme zu steigern, und YiaC reguliert K381la von PncB hoch, um die Aktivität von PncB zu verringern. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass CobB K382la von PykF löscht, um Glykolyse und Bakterienwachstum zu fördern. Unsere Studie zeigt, dass Kla einen weitreichenden regulatorischen Effekt auf den Stoffwechsel in Bakterien hat, der sich von der regulatorischen Transkription von Kla in Eukaryoten unterscheidet11,15. Als Endprodukt der anaeroben Glykolyse in Bakterien (Abb. 7)55 kann Laktat katalysiert werden, um Lactyl-CoA zu produzieren, das ein notwendiges Substrat für die Erzeugung von Kla11 ist. Daher können Metaboliten den Kla-Spiegel intrazellulärer Stoffwechselenzyme wirksam beeinflussen. Umgekehrt zeigt unsere Studie, dass CobB-vermitteltes Kla die Aktivitäten von Stoffwechselenzymen reguliert und die Glykolyse weiter beeinflusst, was auf eine Stoffwechsel-PTM-Metabolismus-Signalkaskade hindeutet, die das Gleichgewicht von Stoffwechsel und PTM reguliert.

Zusammenfassend haben wir ursprünglich das prokaryotische Kla-Regulationssystem identifiziert, in dem YiaC eine Lysin-Actylase ist und CobB als Delactylase fungiert. Anschließend haben wir die endogenen Kandidaten von YiaC und CobB profiliert und so einen Rahmen für die Untersuchung der verschiedenen Funktionen von Kla geschaffen, die durch YiaC und CobB in Prokaryoten reguliert werden. Darüber hinaus haben wir die Eigenschaften des Laktyloms in E. coli beschrieben, das 1047 Kla-Stellen in 478 Proteinen enthält. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass CobB die Aktivität von PykF steigern kann, indem es K382la löscht und so die Glykolyse und das Bakterienwachstum fördert. Unsere Arbeit stellt das Regulierungssystem und das molekulare Netzwerk von Kla vor und bietet neue Einblicke in den Kla-vermittelten Mechanismus zur Regulierung des Stoffwechsels in Bakterien.

E. coli MG1655-Zellen und E. coli MG1655 ΔcobB-Zellen wurden aus unserer vorherigen Studie erhalten8, E. coli BL21 (λDE3) stammte von TIANGEN, E. coli MG1655 ΔyiaC und Gene der GNAT-Familie, die E. coli BL21 (λDE3)-Stämme überexprimierten, waren erhalten aus unserer vorherigen Studie9. Alle Anti-Acyllysin-Antikörper wurden von PTM Biolabs Inc. gekauft. Alle synthetischen Peptide wurden von SciLight Biotechnology, LLC erzeugt. Antikörper (alle 1:1000 verdünnt) und andere Reagenzien sind in den Zusatzdaten 7 aufgeführt.

Diese Methode wurde wie zuvor beschrieben9 durchgeführt. Im Detail wurden Plasmide konstruiert, um Proteine ​​in E. coli zu exprimieren. Wir verwendeten das pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (TRANS), um die Plasmide pET28a-cisY, pET28a-pncB, pET28a-gpmA, pET28a-mdh, pET28a-pykF und pBR322-pykF-His-Tag zu konstruieren. Für die Mutation verwendeten wir das Fast Mutagenesis System (TRANS), um die Vektoren zu konstruieren, die punktmutierte Gene enthalten. Alle für die PCR verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 7 aufgeführt. Die konstruierten Vektoren von pET28a wurden zur Überexpression von Stämmen in E. coli BL21 (λDE3) transformiert. Die konstruierten Vektoren von pBR322 wurden in E. coli MG1655 transformiert und in LB-Medium mit Ampicillin (Amp, 50 μg ml–1) bei 37 °C in Schüttelkolben und 220 U/min kultiviert. über Nacht.

Die mit Gen-pET28a-Vektoren transformierten konstruierten E. coli BL21 (λDE3) wurden in LB-Medium mit Kanamycin (Kana, 50 μg ml–1) bei 16 °C in Schüttelkolben bis zu einer optischen Dichte von 0,6–0,8 bei 600 nm kultiviert . Als nächstes wurden die Zellen mit 0,05 mM IPTG bei 16 °C über Nacht induziert, gefolgt von der Ernte ganzer Zelllysate für Immunblotting oder Proteinreinigung. Die Proteine ​​wurden aus kultivierten Zellen mit Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mg ml–1 Lysozym, 50 U ml–1 Nuklease) geerntet. Anschließend wurden die Proteine ​​mit HisPur Ni-NTA Resin gemischt und mit Waschpuffer (20 mM Na3PO4, 300 mM NaCl, 25 mM Imidazol, pH 7,4) gewaschen, die überexprimierten Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer (20 mM Na3PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4). Die Elution wurde gesammelt und unter Verwendung eines Zentrifugalfiltergeräts Amicon Ultra-0,5 in Lagerpuffer (100 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 7,7 mM KCl, pH 7,0) konzentriert.

Wir haben Lactyl-CoA wie zuvor beschrieben8 synthetisiert. Im Einzelnen wurde Dicyclohexylcarbodiimid zu einer Dimethylformamid-Mischlösung, die Milchsäure und Thiophenol enthielt, gegeben und bei 4 °C gerührt, die Reaktion wurde durch Zugabe von kaltem Wasser gestoppt. Die Lösung wurde mit Ether extrahiert und dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und der Etherextrakt mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, dann wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie (eluiert mit einer 20:1-Mischung aus Ethylacetat und Hexan) gereinigt, gefolgt von Silica-Dünnschichtchromatographie (eluiert mit einer 1:4-Mischung aus Ethylacetat und Hexan). Die Reinigung wurde in 0,1 M Natriumbicarbonat gelöst und dann bei 0 °C zu Natriumbicarbonatpuffer mit Natriumsalz von CoA gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht wurde die Reaktion durch Zugabe von HCl auf einen pH-Wert von 7,0 beendet. Das Endprodukt wurde bei 30 °C vom Wasser abgedampft und mit Ether und Ethylacetat extrahiert.

Diese Methode wurde wie zuvor beschrieben64 durchgeführt. Im Detail wurde das gereinigte Acs oder PrpE mit einer Endkonzentration von 0,3 μM in den Reaktionspuffer [50 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 2,5 mM ATP, 0,5 mM HSCoA, 3 mM Phosphoenolpyruvat, 0,1 mM NADH, 1 U Pyruvatkinase] gegeben , 1,5 U Lactatdehydrogenase, 5 U Myokinase, 10 mM DTT und 0,2 mM organisches Säuresubstrat (Acetat, Lactat und Propionat), pH 7,5] bei 25 °C für 30 Minuten. Nach Abschrecken der Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens 10 % (v/v) Trifluoressigsäure und Reinigung mit C18 ZipTips wurden die Produkte von Actyl-CoA mittels LC-MS/MS analysiert. Jede Reaktion wurde in drei biologischen Wiederholungen durchgeführt.

Diese Methode wurde bereits zuvor beschrieben37. Im Einzelnen wurde E. coli MG1655 in LB-Medium bei 37 °C in geschüttelten Kolben über Nacht kultiviert und die Zellen durch Zentrifugation geerntet, dann Lysatpuffer [50 mM NaH2PO4, 50 mM NaH2PO4 und 5 mM MgCl2, pH 7,0] hinzugefügt und die Zellen aufgebrochen Durch Ultraschall auf Eis wurde der Überstand durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation als gesamtes Proteinlysat extrahiert. Dann wurde die Proteinkonzentration mittels BCA gemessen und die Proteinkonzentration auf 2 mg/ml eingestellt. Durch Zugabe von 5 mM ATP, 2 mM HSCoA, 10 mM DTT und 0,5 mM Laktat in Gesamtproteinlysat als Reaktionssystem wurde die Reaktion 30 Minuten lang bei 25 °C durchgeführt, nachdem die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens von 10 % (v/) gelöscht wurde. v) Trifluoressigsäure und Zentrifugation, der Überstand wurde mit C18 ZipTips gereinigt und die Produkte von Lactyl-CoA wurden mittels LC-MS/MS analysiert. Jede Reaktion wurde in drei biologischen Wiederholungen durchgeführt.

Der Test der YdiF-CoA-Transferase-Aktivität wurde wie zuvor beschrieben40 durchgeführt, mit leichten Modifikationen wie folgt: Die Enzymreaktionen wurden in Phosphatpuffer [50 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4 und 5 mM MgCl2, pH 7,0] mit 1 mM Acetoacetyl- CoA und 10 mM L-Lactat oder Acetat bei 35 °C für 20 Minuten und initialisiert durch Zugabe von 7,5 μg gereinigtem YdiF. Das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung betrug 50 μL. Die Gemische wurden vor dem Start 5 Minuten lang bei der angegebenen Reaktionstemperatur vorinkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des gleichen Volumens 10 % (v/v) Trifluoressigsäure und Zentrifugation beendet, der Überstand wurde mit C18 ZipTips gereinigt und die Produkte von Lactyl-CoA wurden mittels LC-MS/MS analysiert. Jede Reaktion wurde in drei biologischen Wiederholungen durchgeführt.

In Wasser gelöste Proben wurden mit einem Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) Massenspektrometer im positiven ESI-Modus unter Verwendung der zuvor beschriebenen Einstellungen65,66 analysiert. Im Einzelnen wurden die Proben mit einer ACQUITY UPLC BEH C18-Säule (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) getrennt. Der HPLC-Gradient für 15 Minuten wurde wie folgt eingestellt: 0,2 ml/min Fluss bei 98 % Puffer A (Wasser mit 5 mM). Ammoniumacetat) und 2 % Puffer B (95 % Acetonitril in Wasser mit 5 mM Ammoniumacetat) für 0 Minuten, 98 bis 70 % Puffer A für 8 Minuten, 70 bis 2 % Puffer A für 1 Minute, 2 % Puffer A für 3 Min., 2 bis 98 % Puffer A für 1 Min., 98 % Puffer A für 2 Min. Für die MS-Analyse wurde ein Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific) eingesetzt. Die Sprühspannung wurde auf 3,5 kV, der HF-Pegel des Trichters auf 40 und die Temperatur des Ionentransferrohrs auf 320 °C eingestellt. Die Daten wurden von Xcalibur (v.4.0.27.19) gesammelt. Als MS1-Detektor wurde der Orbitrap-Massenanalysator mit einer Auflösung von 120.000 verwendet. Das normalisierte AGC-Ziel und die maximale Injektionszeit wurden für MS1 auf 70 % /Standard festgelegt. Der MS2-Detektor wurde mit einer Auflösung von 15.000 verwendet. Die angestrebte Masseneinstellung ist Lactyl-CoA: 840,1436, Acetyl-CoA: 810,1330 und Propionat-CoA: 824,1487. Das MS2-Isolationsfenster betrug 2 Da und die Massentoleranz 10 ppm. Für die Vorläuferfragmentierung wurde eine normalisierte HCD-Kollisionsenergie (Higher-Energy Collision Induced Dissociation) von 25 % verwendet. Die relative Intensität von Acyl-CoA wurde von Xcalibur (v.4.0.27.19) analysiert.

Diese Methode wurde bereits beschrieben8. Im Detail wurde die Reaktionszelle, die 50 μM YiaC (oder CobB) enthielt, mit dem MicroCal PEAQ-ITC-Titrationskalorimeter (Malvern Instruments) bei 37 °C mit 500 μM verschiedenen Actyl-CoA (oder aktilierten Peptiden) titriert. Das Volumen der ersten Injektion betrug 0,5 μl 500 μM Actyl-CoA (oder aktilierte Peptide), und die folgenden 18 Injektionen betrugen 2,0 μl. Die Bindungsisotherme wurde mit der Origin 8.0-Software (OriginLab) angepasst. Jede Gruppe hatte drei biologische Wiederholungen.

Die CobB-Reaktion wurde wie zuvor beschrieben8. Im Detail wurden laktylierte oder acetylierte Peptide (50 μM) mit 1 μM CobB in CobB-Reaktionspuffer [50 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT und 1 mM NAD+ (pH)] inkubiert 8.5)] mit oder ohne 10 mM NAM für 2 h bei 37 °C. Für die YiaC-Reaktion wurden unmodifiziertes Peptid (50 μM) mit 5 μM YiaC in YiaC-Reaktionspuffer [100 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 10 mM KCl und 0,1 mM Lactyl-CoA oder Acetyl-CoA (PH = 7)] inkubiert 2 Stunden bei 37 °C. Nach dem Abschrecken der Reaktion mit dem gleichen Volumen 10 % (v/v) Trifluoressigsäure wurden die Proben 10 Minuten lang bei 18.000 × g zentrifugiert, um das Enzym abzutrennen. Die Proben wurden durch einen 28-minütigen HPLC-Gradienten getrennt [linearer Gradient von 5 auf 50 % HPLC-Puffer B (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril) für 3 Minuten und dann auf 100 % Puffer B für 20 Minuten und Beibehaltung von 100 % Puffer B für 5 Minuten Mindest].

Diese Methode wurde bereits beschrieben8. CobB wurde mit modifizierten Peptiden (AETAEK(la)YGDEQVK oder AETAEK(ac)YGDEQVK von GpmA) im CobB-Reaktionspuffer 2 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. In der Zwischenzeit wurde YiaC mit unmodifiziertem Peptid (TICHDKAFVK, von PncB) im YiaC-Reaktionspuffer inkubiert. Die Konzentrationen der Peptide betrugen 5, 10, 16, 32, 60 und 285 μM und die Reaktionszeit betrug 1, 5, 15 und 30 Minuten. Nach Abschrecken der Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens 10 % (v/v) Trifluoressigsäure und Reinigung mit C18 ZipTips wurden die Produkte mit einem Autoflex III TOF/TOF-Massenspektrometer (Bruker Daltonics) mit einem Reflex-Positiv-Ionen-Modus analysiert, der mit verzögerten Ionen ausgestattet ist Extraktion. 0,1 μl-Proben, gemischt mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), wurden mittels MS analysiert. Es wurde eine Beschleunigungsspannung von 20 kV verwendet. MS-Daten wurden mit der FlexAnalysis-Software zur Spektralverarbeitung und Peakerkennung analysiert. Die Enzymkinetik wurde mit der Software Prism GraphPad 8.0 analysiert.

Wie zuvor beschrieben8 wurden E. coli MG1655, E. coli MG1655 ΔyiaC und ΔcobB bei 37 °C in M9-Minimalmedium mit 0,2 % Glucose und L-Lysin (100 mg ml–1) oder 13C6-Lysin (100 mg ml–1) kultiviert. 1) wie in Abb. 3A dargestellt. Die Zellen wurden während der mittleren Exponentialphase geerntet und dann auf Eis in PBS beschallt. Nach 20-minütiger Zentrifugation (20.000 g) bei 4 °C wurde der Überstand gesammelt. Gleiche Mengen an Proteinen aus E. coli MG1655 und MG1655 ΔyiaC (oder ΔcobB) wurden gemischt und mit Trichloressigsäure präzipitiert, die Niederschläge wurden in 100 mM NH4HCO3 gelöst und über Nacht mit Trypsin verdaut (Trypsin:Protein-Verhältnis 1:50). Verdaute Produkte wurden mit 10 mM DTT 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer 45-minütigen Alkylierung mit 20 mM Iodacetamid bei Raumtemperatur und Dunkelheit. Überschüssiges Jodacetamid wurde mit 20 mM Cystein blockiert, ein letzter Verdau wurde im Verhältnis 1:100 für 4 Stunden durchgeführt. Die Produkte wurden mit SepPak C18-Kartuschen (Waters) entsalzt und getrocknet.

Tryptische Peptide wurden in NETN-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % Nonidet P-40) erneut gelöst und mit Anti-Lactyllysin-Antikörper-konjugierten Protein-A-Agarosekügelchen (PTM Biolabs) bei 4 inkubiert °C über Nacht, unter sanfter Rotation. Die inkubierten Perlen wurden dreimal mit NETN-Puffer, zweimal mit ETN-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA) und dreimal mit Wasser gewaschen. Gebundene Peptide wurden dreimal mit 1 % Trifluoressigsäure eluiert. Abschließend wurden die Eluate vor der Nano-HPLC-MS/MS-Analyse getrocknet und mit C18 ZipTips (Millipore Corp) gereinigt.

Angereicherte Peptide wurden mittels HPLC-MS/MS analysiert. Die Proben wurden in 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert und dann in ein Nano-LC-System (EASY-nLC 1200, Thermo Fisher Scientific) injiziert. Peptide wurden durch eine 25 cm lange C18-Säule mit 75 µm Innendurchmesser (3 µm, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Deutschland) bei einer Flussrate von 300 nL/min aufgetrennt. Die Gradientenelution wurde 90 Minuten lang mit 2–45 % HPLC-Puffer B (0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril) durchgeführt, dann 15 Minuten lang auf 100 % Puffer B umgestellt und 5 Minuten lang bei 100 % Puffer B gehalten. Für die MS-Analyse wurde ein Orbitrap Eclipse Tribrid-Massenspektrometer mit einer FAIMS Pro-Schnittstelle (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die Sprühspannung wurde auf 2,1 kV, der RF-Pegel des Trichters auf 40 und die Temperatur des Ionentransferrohrs auf 320 °C eingestellt. Die massenspektrometrische Analyse wurde im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) der intensivsten Vorläufer durchgeführt und die Daten wurden mit Xcalibur (v.4.0.27.19) gesammelt. Die Kombination von –40 V/–60 V/–80 V FAIMS CVs (Kompensationsspannung) wurde so eingestellt, dass der DDA-Modus für einen 1-s-Zyklus ausgeführt wird, um einen großen Zyklus von 3 s zu bilden. Als MS1-Detektor wurde der Orbitrap-Massenanalysator mit einer Auflösung von 60.000 und einem Scanbereich von 350–1600 m/z verwendet. Das normalisierte AGC-Ziel und die maximale Injektionszeit wurden für MS1 auf 100 %/20 ms und für MS2 auf 200 %/30 ms eingestellt. Als MS2-Detektor wurde der Orbitrap-Massenanalysator mit einer Auflösung von 17.500 verwendet. Für MS2 wurden Vorläuferionen mit Ladungen von +2 bis +5 isoliert und die dynamische Ausschlusszeit wurde auf 50 s eingestellt. Das MS2-Isolationsfenster betrug 1,6 Da und eine normalisierte HCD-Kollisionsenergie (Higher-Energy Collision Induced Dissociation) von 30 % wurde für die Vorläuferfragmentierung verwendet.

Die Such- und Filterkriterien der Datenbank wurden wie zuvor beschrieben8 durchgeführt. Im Detail wurden die Rohdaten von MaxQuant (v.1.5.5.1) mit der UniProt E. coli K12-Proteindatenbank (Proteom-ID: UP000474145) durchsucht und eine Gesamtfalscherkennungsrate für Peptide von weniger als 1 % ermittelt. Die Suche nach Peptidsequenzen wurde als Trypsinspezifität festgelegt, zwei fehlende Spaltungen für maximale und sieben für minimale Peptidlänge. Als feste Modifikation wurde die Carbamidomethylierung an Cys angegeben. Als variable Modifikationen wurden die Lactylierung an Lysin, die Oxidation von Methionin und die Acetylierung am N-Terminus des Peptids festgelegt. Die Massentoleranzen wurden auf ±10 ppm für Vorläuferionen und ±0,02 Da für MS/MS festgelegt. Lactylierte Peptide mit einem Score von <40 und einer Lokalisierungswahrscheinlichkeit von <0,75 wurden außerdem ausgeschlossen. Wir haben alle Kla-Peptidverhältnisse durch die Verhältnisse der entsprechenden Proteinspiegel normalisiert.

Die GO (Gen-Ontologie)-Funktion in drei Kategorien: BPs (biologische Prozesse), CC (zelluläre Komponente) und MF (molekulare Funktionen) Signalweganreicherung, analysiert durch das R/Bioconductor-Paket „clusterProfiler“ (Version: 4.0)67. Als Cutoff-Kriterien wurden der p-Wert-Cutoff = 0,05 und der q-Wert-Cutoff = 0,2 gewählt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen ungepaarten exakten Fisher-Test berechnet. Zur Anpassung der P-Werte wurde eine Benjamini- und Hochberg-Korrektur verwendet.

Das gereinigte rekombinante YiaC (15 μM) und die Kandidatensubstratproteine ​​(GltA, PncB, 20 μM) wurden 10 Stunden lang in YiaC-Reaktionspuffer bei 25 °C inkubiert. Das gereinigte rekombinante CobB (15 μM) und die Kandidatensubstrate (GpmA, Mdh, PykF, 20 μM) wurden 10 Stunden lang in CobB-Reaktionspuffer bei 25 °C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Western Blot mit Anti-Lactylierung analysiert.

Die Aktivität von gereinigtem PncB, PncBK381Q und PncBK381R wurde wie beschrieben gemessen68. Im Einzelnen wurden die gereinigten Proteine ​​in den Reaktionspuffer [50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2,5 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 25 g Rinderserumalbumin, 1 mM Nikotinsäure und 1 mM 5-Phosphoribosyl-1] gegeben -Pyrophosphat (pH 7,5)] bei 37 °C für 2 Stunden. Die Reaktionen wurden mittels HPLC-MS/MS gemessen, um die Produktion von Nikotinsäure nachzuweisen. Die Trennung wurde auf einem Vanquish UHPLC-System (Thermo Fisher Scientific) mit einer ACQUITY UPLC BEH C18-Säule (100 × 2,1 mm, 1,7 μm) durchgeführt. Die mobile Phase A war 0,1 % Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase B war 0,1 % Ameisensäure in Methanol. Die Gradientenelution (0,0 Min., 0 % B; 2 Min., 15 % B; 4 Min., 100 % B; 5 Min., 0 % B) wurde mit einer Flussrate von 0,2 ml/Min. und einer konstanten Säulentemperatur von 20 °C durchgeführt °C. Das Injektionsvolumen betrug 2 μl. Der Nikotinsäurenachweis wurde mit einem Orbitrap Exploris 480-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland) durchgeführt, das mit einer ESI-Sonde betrieben wurde. Die Daten wurden unter den folgenden Parametern erfasst: Hüllgas ((N2), 35 Arb; Hilfsgas (N2), 10 Arb; Sprühspannung, 3500 V (positiver Modus); und bei Transferrohrtemperatur, 320 °C. Ein SIM war zur Datenerfassung beantragt.

Die Aktivität von gereinigtem GpmA, GpmAK106Q und GpmAK106R wurde wie beschrieben gemessen69. Im Detail wurden die gereinigten rekombinanten GpmA, GpmAK106Q oder GpmAK106R in Reaktionspuffer [100 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM ADP und 0,2 mM NADH (PH 7,0)] mit 0,5 U Enolase, 0,5 inkubiert U-Pyruvatkinase, 0,1 U Ldh und 2 mM 3-Phosphoglycerat für 1 Stunde bei 30 °C, und Proben ohne GpmA dienten als Blindprobe. Die Oxidation von NADH wurde als GpmA-Aktivität durch Autofluoreszenz bei 340 nm gemessen.

Die Aktivität von gereinigtem PykF, PykFK382Q und PykFK382R wurde wie beschrieben gemessen70. Im Detail wurden die gereinigten rekombinanten PykF, PykFK382Q und PykFK382R in Reaktionspuffer [50 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 15 mM MgCl2, 25 % Glycerin, 175 μM NADH, 5 mM Phosphoenolpyruvat, 5 mM ADP und 5] inkubiert mM Fructose-1,6-bisphosphat (PH 8,0)] mit 1 U Lactatdehydrogenase für 10 Minuten bei 32 °C, und Proben ohne PykF dienten als Blindprobe. Die Oxidation von NADH wurde als PykF-Aktivität durch Autofluoreszenz bei 340 nm gemessen.

E. coli in 5 ml Kulturmedium wurden geerntet. Der Assay wurde mit dem Pyruvate Kinase Activity Assay Kit (Sigma-Aldrich, MAK072) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Wie zuvor beschrieben8, wurden die Stämme über Nacht in LB-Medium kultiviert, dann 1:1000 in LB- oder M9-Medium (mit 1 % Glucose oder 1 % Pyruvat) verdünnt und bei 37 °C mit 96-Well-Platten inkubiert und jeder Stamm hinzugefügt zu drei Brunnen. Die Absorption bei 600 nm zu Beginn wurde als Blindwert festgelegt und stündlich mit einem Spektrophotometer gemessen. Alle dynamischen Wachstumskurven wurden mit Origin 8.0 erstellt.

Wir führten drei Mal Molekulardynamiksimulationen (MD) mit zwei Systemen PykF/PykF K382la-FBP für 100 ns durch. Die Anfangskoordinaten der Systeme wurden aus Röntgenkristallstrukturen mit der PDB-ID 1PKY ermittelt. Alle MD-Simulationen wurden mit GROMACS 2019.6 durchgeführt (Standardwerte als Parameter festlegen). Zur Beschreibung des PykF wurde das Softwarepaket mit dem Kraftfeld Gromos 54A7 und für den PykF K382la das Kraftfeld Gromos 54A8 verwendet. Gromos 54A7 und Gromos 54A8 wurden von Vienna-PTM heruntergeladen. Die Liganden-FBP-Kraftfelder wurden aus der Datenbank Automated Topology Builder (ATB) (Version 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md) bezogen. Die komplexen Systeme wurden durch MD-Simulationen in einer kubischen Box mit dem SPC-Wassermodell analysiert. Um die Systeme zu neutralisieren, wurden der Simulationsbox zufällig Chlorid- und Natriumionen zugesetzt. Während der MD-Simulationen wurden die weitreichenden Coulomb-Wechselwirkungen mit der Partikelnetz-Ewald-Methode (PME) behandelt. Die Energieminimierung des gesamten Systems wurde für 50.000 Schritte mit der Methode des steilsten Abstiegs durchgeführt. Anschließend wurden 500 ps NVT (Berendsen-Temperatur gekoppelt mit konstanter Partikelanzahl, -volumen und -temperatur) und 500 ps NPT (Parrinello-Rahman-Druck, gekoppelt mit konstanter Partikelanzahl, -volumen und -temperatur) durchgeführt, um die Stabilität des Systems aufrechtzuerhalten (300 K, 1 bar). Nach der Stabilisierung aller thermodynamischen Eigenschaften wurde das molekulare System für 100 ns mit einem Zeitintervall von 2 fs simuliert, wobei die Koordinaten für alle Modelle alle 2 ps gespeichert wurden. Die quadratischen Mittelabweichungen (RMSD) und Abstände zwischen dem Stickstoffatom der K382-Seitenkette und dem zentralen Kohlenstoffatom von FBP wurden mithilfe der Analysetools in GROMACS 2019.6 ausgewertet. Die gesamte Visualisierung erfolgt über die Software PyMOL und Xmgrace 2.3.7. Codedateien, Eingabeparameterdateien sowie Anfangs- und Endkonfigurationsdateien für zwei MD-Simulationssysteme (PykF-FBP und PykF K382la-FBP) werden als MD-Simulations-Quelldaten bereitgestellt.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder den ergänzenden Materialien enthalten. Zusätzliche Daten zu diesem Artikel können bei den Autoren angefordert werden. Die MS-Proteomikdaten wurden über das iProX-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD030345 und PXD030346 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt. Die Liganden-FBP-Kraftfelder wurden aus der Datenbank Automated Topology Builder (ATB) (Version 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md) bezogen. Für die Analyse wurde die folgende Kristallstruktur PDB ID 1PKY verwendet. Codedateien, Eingabeparameterdateien sowie anfängliche und endgültige Konfigurationsdateien für zwei MD-Simulationssysteme (PykF-FBP und PykF K382la-FBP) werden als MD-Simulations-Quelldaten bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Sabari, BR, Zhang, D., Allis, CD & Zhao, Y. Stoffwechselregulierung der Genexpression durch Histon-Acylierungen. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 18, 90–101 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Choudhary, C., Weinert, BT, Nishida, Y., Verdin, E. & Mann, M. Die wachsende Landschaft der Lysinacetylierung verbindet Stoffwechsel und Zellsignalisierung. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 15, 536–550 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ren, J., Sang, Y., Lu, J. & Yao, YF Proteinacetylierung und ihre Rolle bei der bakteriellen Virulenz. Trends Mikrobiol. 25, 768–779 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, R., Chen, P., Gu, J. & Deng, JY Acetylierung verringert die Fähigkeit von CheY, sich einer Autophosphorylierung zu unterziehen. FEMS Mikrobiol. Lette. 347, 70–76 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liang, W., Malhotra, A. & Deutscher, MP Acetylierung reguliert die Stabilität eines bakteriellen Proteins: Wachstumsphasenabhängige Modifikation von RNase R. Mol. Zelle 44, 160–166 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK ist eine N(epsilon)-Lysin-Acetyltransferase, die das Histon-ähnliche Protein HBsu in Bacillus subtilis direkt acetyliert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 116, 3752–3757 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. Systematische Identifizierung von Lysin-2-hydroxyisobutterylierten Proteinen in Proteus mirabilis. Mol. Zellproteom. 17, 482–494 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Dong, H. et al. Protein-Lysin-De-2-hydroxyisobutterylierung durch CobB in Prokaryoten. Wissenschaft. Adv. 5, eaaw6703 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. TmcA fungiert als Lysin-2-Hydroxyisobutyryltransferase zur Regulierung der Transkription. Nat. Chem. Biol. 18, 142–151 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zheng, Y. et al. Auswirkungen der Lysin-2-hydroxyisobutterylierung auf die bakterielle FabI-Aktivität und die Resistenz gegen Triclosan. Biochimie 182, 197–205 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, D. et al. Stoffwechselregulierung der Genexpression durch Histon-Laktylierung. Natur 574, 575–580 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irizarry-Caro, RA et al. Der TLR-Signaladapter BCAP reguliert den Übergang von entzündlichen zu reparatorischen Makrophagen, indem er die Histon-Laktylierung fördert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 30628–30638 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dichtl, S. et al. Laktat und IL6 definieren trennbare Wege der entzündlichen Stoffwechselanpassung. Wissenschaft. Adv. 7, eabg3505 (2021).

Cui, H. et al. Lungenmyofibroblasten fördern die profibrotische Aktivität von Makrophagen durch Laktat-induzierte Histon-Laktylierung. Bin. J. Atmung. Zellmol. Biol. 64, 115–125 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L. et al. Glis1 erleichtert die Induktion der Pluripotenz über eine Epigenom-Metabolom-Epigenom-Signalkaskade. Nat. Metab. 2, 882–892 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, J. et al. Laktat moduliert den Zellstoffwechsel durch Histon-Laktylierung-vermittelte Genexpression bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Vorderseite. Oncol. 11, 647559 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, J. et al. Die Histon-Laktylierung treibt die Onkogenese voran, indem sie die Expression des m(6)A-Reader-Proteins YTHDF2 im Augenmelanom erleichtert. Genombiol. 22, 85 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hagihara, H. et al. Durch neuronale Erregung induzierte Proteinlaktylierung. Cell Rep. 37, 109820 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, K. et al. Laktat fördert die Laktylierung, Acetylierung und exosomale Freisetzung von Makrophagen HMGB1 bei polymikrobieller Sepsis. Zelltod ist unterschiedlich. 29, 133–146 (2021).

Meng, X., Baine, JM, Yan, T. & Wang, S. Umfassende Analyse der Lysin-Lactylierung in Reiskörnern (Oryza sativa). J. Agrarlebensmittelchemie. 69, 8287–8297 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gao, M., Zhang, N. & Liang, W. Systematische Analyse der Lysinlactylierung im Pflanzenpilzpathogen Botrytis cinerea. Vorderseite. Mikrobiol. 11, 594743 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, S., Zhang, X. & Li, H. Jenseits der Histon-Acetylierung – Schreiben und Löschen von Histon-Acylierungen. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 53, 169–177 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, M. & Lin, H. Verständnis der Funktion von Säugetier-Sirtuinen und der Protein-Lysin-Acylierung. Annu. Rev. Biochem. 90, 245–285 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Narita, T., Weinert, BT & Choudhary, C. Funktionen und Mechanismen der Acetylierung von Nicht-Histon-Proteinen. Nat. Pfr. Fr. Mol. Zellbiol. 20, 156–174 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moreno-Yruela, C. et al. Histon-Deacetylasen der Klasse I (HDAC1-3) sind Histon-Lysin-Delactylasen. Wissenschaft. Adv. 8, eabi6696 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dancy, BM & Cole, PA Protein-Lysin-Acetylierung durch p300/CBP. Chem. Rev. 115, 2419–2452 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. KAT2A fungiert in Verbindung mit dem α-KGDH-Komplex als Histon-H3-Succinyltransferase. Natur 552, 273–277 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabari, BR et al. Intrazelluläres Crotonyl-CoA stimuliert die Transkription durch p300-katalysierte Histon-Crotonylierung. Mol. Zelle 58, 203–215 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rardin, MJ et al. SIRT5 reguliert das mitochondriale Lysin-Succinylom und die Stoffwechselnetzwerke. Zellmetabolismus 18, 920–933 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, W. et al. Histondeacetylasen der Klasse I sind wichtige Histondecrotonylasen: Hinweise auf eine entscheidende und umfassende Funktion der Histoncrotonylierung bei der Transkription. Zellauflösung 27, 898–915 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Christensen, DG et al. Mechanismen, Nachweis und Relevanz der Proteinacetylierung in Prokaryoten. mBio. 10, e02708-18 (2019).

Christensen, DG et al. Identifizierung neuer Protein-Lysin-Acetyltransferasen in Escherichia coli. mBio. 9, e01905-18 (2018).

Starai, VJ, Celic, I., Cole, RN, Boeke, JD & Escalante-Semerena, JC Sir2-abhängige Aktivierung der Acetyl-CoA-Synthetase durch Deacetylierung von aktivem Lysin. Science 298, 2390–2392 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Colak, G. et al. Identifizierung von Lysin-Succinylierungssubstraten und des Succinylierungs-regulierenden Enzyms CobB in Escherichia coli. Mol. Zellproteom. 12, 3509–3520 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Frye, RA Phylogenetische Klassifizierung prokaryotischer und eukaryotischer Sir2-ähnlicher Proteine. Biochem. Biophys. Res. Komm. 273, 793–798 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weinert, BT et al. Acetylphosphat ist ein entscheidender Faktor für die Acetylierung von Lysin in E. coli. Mol. Zelle 51, 265–272 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Megraw, RE, Reeves, HC & Ajl, SJ Bildung von Lactyl-Coenzym A und Pyruvyl-Coenzym A aus Milchsäure durch Escherichia coli. J. Bakteriol. 90, 984–988 (1965).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prabhu, R., Altman, E. & Eiteman, MA Laktat- und Acrylatstoffwechsel durch Megasphaera elsdenii unter Batch- und Steady-State-Bedingungen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 8564–8570 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JW & Trinh, CT Mikrobielle Biosynthese von Laktatestern. Biotechnologie. Biokraftstoffe 12, 226 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, X. et al. Screening, Expression, Reinigung und Charakterisierung von CoA-Transferasen zur Lactoyl-CoA-Erzeugung. J. Ind. Microbiol. Biotechnologie. 46, 899–909 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dyda, F., Klein, DC & Hickman, AB GCN5-verwandte N-Acetyltransferasen: ein struktureller Überblick. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struktur. 29, 81–103 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goncheva, MI, Chin, D. & Heinrichs, DE Nukleotidbiosynthese: die Grundlage der bakteriellen Pathogenese. Trends Mikrobiol. 30, 793–804 (2022).

Sellés Vidal, L., Murray, JW & Heap, JT Vielseitiger selektiver Evolutionsdruck unter Nutzung synthetischer Defekte im universellen Stoffwechsel. Nat. Komm. 12, 6859 (2021).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q. et al. Die Acetylierung von Stoffwechselenzymen koordiniert die Nutzung der Kohlenstoffquelle und den Stoffwechselfluss. Wissenschaft 327, 1004–1007 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monahan, LG, Hajduk, IV, Blaber, SP, Charles, IG & Harry, EJ Koordinierung der bakteriellen Zellteilung mit der Nährstoffverfügbarkeit: eine Rolle für die Glykolyse. mBio 5, e00935–00914 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Collins, RA, McNally, T., Fothergill-Gilmore, LA und Muirhead, H. Eine Mutante der Untereinheitsschnittstelle der Hefepyruvatkinase benötigt für ihre Aktivität den allosterischen Aktivator Fructose-1,6-bisphosphat. Biochem. J. 310, 117–123 (1995).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siddiquee, KA, Arauzo-Bravo, MJ & Shimizu, K. Wirkung einer Pyruvatkinase (pykF-Gen)-Knockout-Mutation auf die Kontrolle der Genexpression und der Stoffwechselflüsse in Escherichia coli. FEMS Mikrobiol. Lette. 235, 25–33 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mattevi, A. et al. Kristallstruktur der Pyruvatkinase Typ I aus Escherichia coli: molekulare Grundlage des allosterischen Übergangs. Struktur 3, 729–741 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Valentini, G. et al. Die allosterische Regulation der Pyruvatkinase. J. Biol. Chem. 275, 18145–18152 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Donovan, KA et al. Konformationsdynamik und Allosterie in der Pyruvatkinase. J. Biol. Chem. 291, 9244–9256 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rabinowitz, JD & Enerback, S. Laktat: das hässliche Entlein des Energiestoffwechsels. Nat. Metab. 2, 566–571 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Certo, M., Tsai, CH, Pucino, V., Ho, PC & Mauro, C. Laktatmodulation von Immunantworten in entzündlichen gegenüber Tumor-Mikroumgebungen. Nat. Rev. Immunol. 21, 151–161 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, F. & Simon, MC Krebszellen leben nicht allein: Stoffwechselkommunikation innerhalb der Tumormikroumgebung. Entwickler Zelle 54, 183–195 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teusink, B. & Smid, EJ Modellierungsstrategien für die industrielle Nutzung von Milchsäurebakterien. Nat. Rev. Microbiol. 4, 46–56 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, T., Gao, C., Ma, C. & Xu, P. Mikrobielle Laktatverwertung: Enzyme, Pathogenese und Regulierung. Trends Mikrobiol. 22, 589–599 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brown, AJ, Brown, GD, Netea, MG & Gow, NA Der Stoffwechsel beeinflusst die Immunogenität und Pathogenität von Candida auf mehreren Ebenen. Trends Mikrobiol. 22, 614–622 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olive, AJ & Sassetti, CM Metabolischer Crosstalk zwischen Wirt und Krankheitserreger: Wahrnehmung, Anpassung und Konkurrenz. Nat. Rev. Microbiol. 14, 221–234 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oliphant, K. & Allen-Vercoe, E. Makronährstoffstoffwechsel durch das menschliche Darmmikrobiom: wichtige Fermentationsnebenprodukte und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit des Wirts. Mikrobiom 7, 91 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK ist eine N-Epsilon-Lysin-Acetyltransferase, die das Histon-ähnliche Protein HBsu in Bacillus subtilis direkt acetyliert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 116, 3752–3757 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, AR & Escalante-Semerena, JC Modulation der bakteriellen CobB-Sirtuin-Deacylase-Aktivität durch N-terminale Acetylierung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 15895–15901 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinert, BT et al. Acetylierungsdynamik und Stöchiometrie in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Syst. Biol. 10, 716 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, X. et al. Acetat fungiert als epigenetischer Metabolit zur Förderung der Lipidsynthese bei Hypoxie. Nat. Komm. 7, 11960 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, H., Kang, J., Qi, Q. & Chen, G. Produktion von Laktat in Escherichia coli durch genetische und physiologische Redoxregulation. Appl. Biochem. Biotechnologie. 164, 162–169 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jeter, VL & Escalante-Semerena, JC Die Sirtuin-abhängige reversible Lysinacetylierung steuert die Aktivität der Acetyl-Coenzym-A-Synthetase in Campylobacter jejuni. J. Bakteriol. 203, e0033321 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Frey, AJ et al. Die hochauflösende LC-Quadrupol/Orbitrap-Massenspektrometrie ermöglicht die stabile isotopenaufgelöste gleichzeitige Quantifizierung und ¹³C-Isotopenmarkierung von Acyl-Coenzym-A-Thioestern. Anal. Bioanal. Chem. 408, 3651–3658 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varner, EL et al. Quantifizierung von Lactoyl-CoA (Lactyl-CoA) durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Säugetierzellen und -geweben. Öffnen Sie Biol. 10, 200187 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, T. et al. ClusterProfiler 4.0: ein universelles Anreicherungstool zur Interpretation von Omics-Daten. Innovation 2, 100141 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hara, N. et al. Erhöhung der zellulären NAD-Spiegel durch Nikotinsäure und Beteiligung der Nikotinsäure-Phosphoribosyltransferase in menschlichen Zellen. J. Biol. Chem. 282, 24574–24582 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hitosugi, T. et al. Die Tyr26-Phosphorylierung von PGAM1 verschafft Tumoren einen metabolischen Vorteil, indem sie die aktive Konformation stabilisiert. Nat. Komm. 4, 1790 (2013).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Dombrauckas, JD, Santarsiero, BD & Mesecar, AD Strukturelle Basis für die allosterische Regulation und Katalyse der Tumorpyruvatkinase M2. Biochemistry 44, 9417–9429 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 22074103 für KZ, 21874100 für KZ, 22274114 für KZ, 32101023 für HD, 21904097 für GZ und 22004091 für XB), der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (Nr. 2022A1515011810 an HD), die China Postdoctoral Science Foundation (Nr. 2021M702067 an HD), die Tianjin Municipal Science and Technology Commission (Nr. 19JCZDJC35000 an KZ und 19JCQNJC08900 an ST) und das Innovative Team Grant des Guangdong Department of Education (Nr. 2021KCXTD005 an). EL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hanyang Dong, Jianji Zhang.

Die Provinz und das Ministerium waren Co-Sponsoren des Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, des Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Bildungsministerium), des Tianjin Key Laboratory of Medical Epigenetics, der Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, der School of Basic Medical Sciences der Tianjin Medical University , 300070, Tianjin, China

Hanyang Dong, Jianji Zhang, Hui Zhang, Yue Han, Chen Chen, Xiaoxia Tan, Siyu Wang, Xue Bai, Guijin Zhai, Shanshan Tian, ​​​​Tao Zhang & Kai Zhang

Schlüssellabor für Infektionskrankheiten und molekulare Immunpathologie der Provinz Guangdong, Institut für onkologische Pathologie, Shantou University Medical College, 515041, Shantou, Guangdong, China

Hanyang Dong, Enmin Li und Liyan Xu

Hochschule für Biowissenschaften, Nankai-Universität, 300071, Tianjin, China

Congcong Lu

Jingjie PTM Biolab (Hangzhou) Co. Ltd, Hangzhou, 310018, Zhejiang, China

Zhongyi Cheng

Das Schlüssellabor für Molekularbiologie für das Chaoshan-Küstengebiet mit hoher Krebsinzidenz, Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Shantou University Medical College, 515041, Shantou, Guangdong, China

Enmin Li

Tianjin Key Laboratory of Retinal Functions and Diseases, Eye Institute and School of Optometry, Tianjin Medical University Eye Hospital, Tianjin Medical University, 300070, Tianjin, China

Kai Zhang

Tianjin Key Laboratory of Digestive Diseases, Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Allgemeines Krankenhaus der Medizinischen Universität, Medizinische Universität Tianjin, 300070, Tianjin, China

Kai Zhang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

KZ und LX überwachten die Experimente. HD und KZ entwarfen Experimente, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. HD und JZ führten Zellkulturen, enzymatische Tests, Metabolomik-Untersuchungen und molekularbiologische Analysen durch. HD, JZ, CL, HZ und XB führten die proteomische Untersuchung und massenspektrometrische Analyse durch. GZ und CC stellten Reagenzien für die Untersuchung von Proteinfunktionen her. HD, JZ, YH, XT, SW, ST, ZC, TZ, EL, LX und KZ führten die Datenerfassung, -analyse und -interpretation durch. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Liyan Xu oder Kai Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dong, H., Zhang, J., Zhang, H. et al. YiaC und CobB regulieren die Lysin-Laktylierung in Escherichia coli. Nat Commun 13, 6628 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 13. Januar 2022

Angenommen: 20. Oktober 2022

Veröffentlicht: 04. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.