Verwendung von Monolith

Jun 14, 2023

Abbildung 1:Chromatogramm aus der Analyse einer IVT-Reaktion mit einer CIMac PrimaS-Monolith-Chromatographiesäule.

Die In-vitro-Transkription (IVT) ist ein entscheidender Schritt bei der Produktion von Messenger-RNA (mRNA). In einem Webinar im März 2022 erklärte Rok Sekirnik (Leiter der Prozessentwicklung für mRNA- und Plasmid-DNA-(pDNA)-Anwendungen bei BIA Separations, Teil von Sartorius), dass die Optimierung der Konzentrationen der während der IVT verwendeten Reagenzien dazu beiträgt, die Menge der produzierten mRNA zu maximieren. Arzneimittelentwickler haben einen großen Bedarf an Analysemethoden, die die IVT in Echtzeit messen können. Sekirnik zeigte, wie CIMac PrimaS-Monolith-Chromatographiesäulen eine Online-Analyse von IVT ermöglichen, einschließlich der Konzentrationsüberwachung von Nukleosidtriphosphaten (NTPs), Capping-Reagenzien und Plasmiden.

Die Präsentation Sekirnik stellte fest, dass ein 4.000 Nukleotide langes mRNA-Molekül, wie es in mRNA-Impfstoffen gegen SARS-CoV-2 vorkommt, ~1,3 MDa ist – etwa zehnmal größer als ein Standard-IgG-Antikörper. Boten-RNA trägt außerdem eine negative Ladung und wird hydrophob, wenn sie hohen Salzkonzentrationen ausgesetzt wird. Um die Proteintranslation zu ermöglichen, muss es eine 5′-Kappe und einen polyadenylierten (Poly-A) Schwanz haben. Poly-A-Schwänze können in die für die Transkription verwendete DNA-Matrize kodiert oder nach der IVT enzymatisch hinzugefügt werden. Ebenso können 5‘-Kappen während oder nach der IVT hinzugefügt werden.

Angesichts dieser Eigenschaften benötigen Arzneimittelentwickler Analysemethoden, mit denen die mRNA-Ausbeute und die Capping-Effizienz in Echtzeit gemessen werden können. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist für solche Auswertungen hilfreich, aber Analytiker müssen ein Trennmedium auswählen, das eine geeignete Bindungschemie, eine ausreichend große Oberfläche für mRNA und die Möglichkeit für schnelle Analysen bietet. In Medien auf Perlenbasis, die poröse Partikel enthalten, begrenzt die Diffusion den Massentransfer, was lange Analysezeiten erfordert und die Möglichkeit einer Analyse in der Produktionslinie einschränkt. Perlen erzeugen außerdem einen Gegenstrom, wodurch eine Scherspannung entsteht, die die Erholung verringert.

CIMac PrimaS-Monolithsäulen basieren auf dem konvektiven Massentransport durch eine stationäre Polymethacrylatphase. Die Trennung basiert auf multimodalen Anionenaustausch- und Wasserstoffbrückenwechselwirkungen. Die laminare Strömung durch die Säule minimiert die Scherspannung. Im Vergleich zu porösen Partikeln bieten die Mikrokanäle eine viel größere Oberfläche für die mRNA-Bindung. Da es in den Kanälen keine Dead-End-Poren gibt, bleiben ihre Bindungskapazität und Auflösung über alle Flussraten hinweg gleich.

Diese Funktion ermöglicht es Analysten, Proben schnell genug zu verarbeiten, um IVT in Echtzeit auszuwerten, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen. Sekirnik stellte fest, dass ein Assay mRNA, pDNA, Capping-Reagenzien und verschiedene NTPs trennen und quantifizieren kann (Abbildung 1). Ergebnisse werden in weniger als drei Minuten generiert.

Solche Fähigkeiten ermöglichen die Überwachung und Kontrolle der mRNA-Produktionskinetik, einschließlich der 5′-Capping-Effizienz. Sekirnik erklärte, dass, wenn eine Exonuklease verwendet wird, die unverkappte mRNA selektiv abbaut, eine Probe auf ihre mRNA-Konzentration analysiert, enzymatisch behandelt und erneut analysiert werden kann, um die unverdauten Moleküle zu quantifizieren. Der Vergleich der Konzentrationswerte vor und nach der Behandlung zeigt die Capping-Effizienz einer IVT-Reaktion. Analysten können Fütterungspläne und Reagenzkonzentrationen entsprechend anpassen, um das mRNA-Capping und die Ausbeute zu optimieren.

Sekirnik demonstrierte diese Möglichkeit anhand von Daten aus einem Fed-Batch-IVT-Prozess. Sartorius leitete die IVT mit einem Verhältnis von Guanosintriphosphat (GTP) zu Antireverse-Cap-Analogon (ARCA) von 1:4 ein. Eine Stunde nach Beginn des Prozesses war die Verkappungseffizienz hoch (80 %), aber die Ausbeute war gering. Anschließend nutzte das Team eine Fütterungsstrategie, um die NTP-Werte während der Reaktion anzupassen und gleichzeitig das GTP:ARCA-Verhältnis beizubehalten. Solche Änderungen steigerten die Ausbeute um das Sechsfache (auf 11,7 mg/ml), ohne die Verschließeffizienz (80 %) oder die Produktqualität zu beeinträchtigen.

Mithilfe eines solchen Workflows können Analysten schnell Informationen über die Effizienz und den Ertrag der Deckelung erhalten. Die Sartorius PATfix-Software umfasst vorinstallierte Analysesequenzen und Tools zur Erleichterung der Prozessüberwachung. Das Unternehmen bietet auch Monolithsäulen mit anderen Bindungschemikalien an, um mehrere Werkzeuge für die mRNA-Herstellung und Prozessanalytik bereitzustellen.

Fragen und Antworten Können CIMac PrimaS-Säulen in HPLC-Systemen mit quaternären Pumpen verwendet werden? CIMac-Analysesäulen können mit HPLC-Systemen verwendet werden; quaternäre Pumpen werden bevorzugt.

Können die Säulen die mRNA-Polyadenylierung charakterisieren?CIMac Oligo dT-Säulen können zur Quantifizierung des Gehalts an polyadenylierter mRNA verwendet werden.

Der aufgezeichnete Webcast kann jetzt auf Abruf angesehen werden: Jetzt ansehen.

Kategorien: Fragen Sie die Experten, Downstream, Juni 2022, Gesponserte Inhalte