Pilz β

Mar 14, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 576 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die menschliche Darmmikrobiota (HGM) besteht aus einem sehr komplexen Netzwerk von Mikroorganismen, die mit dem Wirt interagieren und so die Gesundheit und das Wohlbefinden des Wirts beeinflussen. β-Glucan hat sich als Nahrungspolysaccharid erwiesen, das das Wachstum bestimmter darmassoziierter Bakterien unterstützt, darunter Mitglieder der Gattungen Bacteroides und Bifidobacterium, wobei letztere als nützliche oder probiotische Bakterien gelten. Der genaue Mechanismus, der dem β-Glucan-Metabolismus durch Darmkommentalen zugrunde liegt, ist jedoch nicht vollständig geklärt. Wir zeigen, dass Mykoprotein eine ausgezeichnete Quelle für β-Glucan darstellt, das von bestimmten Bacteroides-Arten als primäre Abbauprodukte verbraucht wird, wie z. B. Bacteroides cellulosilyticus WH2. Das letztgenannte Bakterium nutzt zwei extrazelluläre, endoaktive Enzyme, die zu den Glycosidhydrolase-Familien 30 und 157 gehören, um aus Mykoproteinen gewonnenes β-Glucan abzubauen und dadurch Oligosaccharide in das Wachstumsmedium freizusetzen. Diese freigesetzten Oligosaccharide können wiederum von anderen Darmmikroben wie Bifidobacterium und Lactiplantibacillus verwertet werden, die somit als sekundäre Abbauer wirken. Wir verwendeten einen Cross-Feeding-Ansatz, um zu verfolgen, wie beide Arten in der Co-Kultur wachsen können.

Die menschliche Darmmikrobiota (HGM) ist ein komplexes Ökosystem von Mikroben, die sich angeblich positiv auf die menschliche Gesundheit auswirken. Nahrungskohlenhydrate stellen die Hauptenergiequelle für den menschlichen Körper dar, obwohl uns die enzymatischen Fähigkeiten fehlen, die meisten dieser Glykane selbst abzubauen1. Das HGM kodiert jedoch für ein Arsenal kohlenhydrataktiver Enzyme (CAZYmes), die in der Lage sind, solche Kohlenhydrate abzubauen1. Die metabolischen Endprodukte der Glykan-Fermentation durch das HGM sind hauptsächlich SCFAs wie Propionat, Acetat und Butyrat, die vielfältige positive Auswirkungen auf den menschlichen Wirt haben. Ein Ungleichgewicht in der Zusammensetzung der Darmmikrobengemeinschaft, manchmal auch als Dysbiose bezeichnet, ist ein Merkmal von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), Darmkrebs, Fettleibigkeit, Clostridioides-difficile-Infektionen und möglicherweise einer Vielzahl anderer Erkrankungen2,3,4.

Wie oben erwähnt, handelt es sich bei HGM um ein komplexes Mikrobennetzwerk, das etwa 10 Billionen Bakterien umfasst5. Dennoch dominieren in dieser komplexen Bakteriengemeinschaft nur zwei Phyla, nämlich Bacteroidota und Bacillota, ergänzt durch Vertreter mehrerer kleinerer Phyla, wie Actinomycetota oder Verrucomicrobiota. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Mitglieder der Gattung Bacteroides spezifische Cluster co-regulierter Gene enthalten, die ein bestimmtes Glykan metabolisieren und als Polysaccharide Utilization Loci (Singular: PUL, Plural: PULs) bezeichnet werden. Ein bestimmter PUL enthält die Gene, die zum Erkennen, Transportieren und Abbauen eines bestimmten Glykans erforderlich sind6,7,8. Beispielsweise beherbergt das Genom von Bacteroides thetaiotaomicron (Ba. thetaiotaomicron VPI-5482, BT) laut der CAZY-Datenbank 96 verschiedene PULs9,10, während eine andere Bacteroides-Art, Ba. ovatus ATCC8483 (Bacova) umfasst 115 verschiedene PULs. Im Allgemeinen initiiert eine zelloberflächenassoziierte Glykosidhydrolase (GH) oder Polysaccharidlyase (PL) den extrazellulären Polysaccharidabbau und ermöglicht so die Freisetzung der resultierenden Oligosaccharide in das Wachstumsmedium11,12,13,14,15,16,17.

Mitglieder der Gattung Bifidobacterium kommen besonders häufig bei voll ausgetragenen, gestillten Säuglingen vor, wo sie vermutlich wichtige positive Wirkungen haben18,19,20,21. Die Dominanz dieser Bakterien in dieser Nische wird zumindest teilweise auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, (bestimmte) menschliche Milch-Oligosaccharide (HMOs) als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verstoffwechseln22. Verschiedene Bifidobakterienarten haben besondere Präferenzen für den Verzehr von HMO, beispielsweise Bi-Stämme. breve und Bi. longum sind dafür bekannt, Lacto-N-tetraose23,24,25,26 zu internalisieren und zu metabolisieren, während Bi. catenulatum subsp. Kashiwanohense kann 2-Fucosyllactose als Kohlenstoffquelle nutzen19,27. Der prototypische Stamm Bi. Es wurde gezeigt, dass breve UCC2003 mehrere HMOs und andere Poly-/Oligosaccharide aus der Nahrung verstoffwechselt, entweder allein23,28 oder durch Kreuzfütterung mit anderen Mitgliedern der Darmmikrobiota; Beispiele für solche saccharidischen Substrate sind Mucin29,30, Arabinogalactan/Galactan31,32 und Sialyllactose20.

β-Glucan ist ein komplexes Glykan, das als potenzielles Präbiotikum erforscht wurde und besonders häufig in Getreide und Pilzzellwänden vorkommt13,33,34,35,36. Aus Getreide gewonnenes β-Glucan mit einer definierten β-1,3/1,4-Mischbindung (Abb. 1A) wurde eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, durch die bestimmte Bacteroides-Arten in der Lage sind, dieses zu erkennen, zu internalisieren und abzubauen Polymer13,34,35,36. Beispielsweise verwendet Bacova einen PUL mit einer Zelloberflächen-assoziierten Glykosidhydrolase 16 (GH16) und einem periplasmatischen GH3, um den Abbau dieses gemischt verknüpften Getreide-β-Glucan34,35,36 zu katalysieren.

A Strukturen von Pilz- (Mykoprotein), Hefe, Laminarin, Gerste und Pustulan-β-Glucan. B Wachstum von Bacteroides ovatus, DSM, WH2 und BT auf Mykoprotein, gemessen auf einem Plattenlesegerät. Alle Wucherungen wurden in 3 verschiedenen unabhängigen Replikaten erzeugt (n = 3). C Anzahl der von Baccell WH2 exprimierten Proteine ​​bei Verwendung von β-Glucan aus Mykoprotein, wie durch Proteomanalyse identifiziert. Die Proteomik wurde in 3 verschiedenen unabhängigen Replikaten erstellt (n = 3). D-GUL-Struktur in Baccell WH2 (GUL-1 und GUL-2) und BT, die auf Mykoprotein, Hefe und Pustulan wirken.

Darüber hinaus ein Ba. uniformis ATCC8492 PUL, das am Metabolismus verwandter β-1,3-Glucane in Hefe und dem Seetang-Glucan Laminarin beteiligt ist (Abb. 1A), ist für den anfänglichen Abbau an der Zelloberfläche durch eine Glycosidhydrolase 16 (GH16) verantwortlich ) und ein GH158 sowie ein anschließend wirkendes periplasmatisches GH313. Darüber hinaus Ba. Der uniformis-Stamm JCM13288 kann Laminarin-, Pustulan- und Porphyran-β-Glucane abbauen, indem er zwei PULs verwendet, die für GH16, GH30, GH158 und GH3 kodieren, und Oligosaccharide mit anderen Darmmikrobiota-Mitgliedern teilt, was möglicherweise die Darmhomöostase unterstützt37.

Eine andere Art von β-1,6-Glucan, das als lineares Glucan in der Flechte Lasallia pustulata und als lineares Glucan, jedoch vernetzt mit anderen Zellwandbestandteilen, in der Hefe Saccharomyces cerevisiae oder im Mandelpilz (Agaricus blazei) vorkommt, wird von BT über einen PUL verwendet, an dem nur ein oberflächennahes GH30_3 und ein periplasmatisches GH317,33 beteiligt sind. Über den Abbau von pilzlichem β-Glucan, beispielsweise dem aus Mykoprotein von Fusarium venenatum, einem Pilz, der von Quorn® als funktionelle Lebensmittelzutat eingesetzt wird, ist wenig bekannt38. Die chemische Struktur dieses β-Glucans besteht aus einem linearen β-1,3-Glucan-Rückgrat, das Seitenketten von β-1,6-Glucanen trägt, wodurch es sich von Getreide-β-Glucan oder Hefe-β-Glucan/Laminarin unterscheidet. wobei entweder die Kernketten- oder die Seitenkettenverknüpfungen unterschiedlich sind13,34,39 (Abb. 1A).

Derzeit gibt es nur wenige Veröffentlichungen, in denen die gesundheitlichen Vorteile von Bacteroidota beschrieben werden (tatsächlich gelten einige Arten als opportunistische Krankheitserreger)40,41. Es kann jedoch argumentiert werden, dass bestimmte Bacteroides-Arten primäre Glykanabbauer darstellen, die eine gegenseitige Kohlenhydratzufuhr durch andere, nützliche Mitglieder der Mikrobiota ermöglichen, wie z. B. Bifidobakterien (von denen bekannt ist, dass sie β-Glucan nicht direkt verstoffwechseln können). Solche metabolischen Wechselwirkungen treten zwischen BT und Bi auf. longum und zwischen Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSMZ) und Bi. breve UCC2003, wenn es auf Lärchen-Arabinogalactan-Protein (AGP) als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird31,42,43. Weitere trophische Wechselwirkungen wurden zwischen verschiedenen Arten von Bacteroides und Bifidobacterium39,44,45,46,47,48 festgestellt, müssen jedoch für das Mykoprotein β-Glucan noch definiert werden.

In der aktuellen Studie führten wir eine molekulare Charakterisierung des Mykoprotein- und Hefe-β-Glucan-Abbaus durch Bacova, Ba durch. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) und BT, was die PUL-Architektur dieser Bacteroides spp. hervorhebt. Darüber hinaus haben wir Kreuzfütterungswechselwirkungen zwischen Bacteroides als primärem Abbauer und bestimmten Arten von Bifidobacterium und Lactiplantibacillus entdeckt, die als sekundäre Abbauer von Mykoprotein-abgeleitetem Pilz-β-Glucan fungieren.

Bestimmte Mitglieder der Gattung Bacteroides wurden als generalistische Fermenter der gemischten Bindung (Gerste) und Hefe-β-Glucan13,34,35,36,37 etabliert. Die Genome dieser Bacteroides-Arten umfassen verschiedene PULs (hier als Glucan Utilization Loci oder GULs bezeichnet), um dieses komplexe Glykan abzubauen, wobei für diesen Stoffwechselprozess kodierte Glykosidhydrolasen eingesetzt werden. Um die Fähigkeit von Bacteroides-Arten zu beurteilen, aus Pilzen gewonnenes β-Glucan zu verwenden, extrahierten wir dieses Polysaccharid aus dem Mykoprotein von Fusarium venenatum (siehe „Materialien und Methoden“) und untersuchten die 23 bekanntesten, darmassoziierten Bacteroidetes-Arten auf ihre Wachstumsfähigkeit auf diesem Glykan sowie auf aus Hefe gewonnenem β-Glukan (Tabelle S1). Unter den verwendeten (anaeroben) Bedingungen beträgt Ba. Xylanisolvens, Ba. intestinalis, Bacova, Ba. fragilis, Ba. finegoldii, Ba. vulgatus, Ba. Es wurde gezeigt, dass uniformis, BT (partielles Wachstum), Dysgonomonas gadei, D. mossii und zwei Baccell-Stämme (Baccell WH2 und Baccell DSMZ) aus Mykoprotein gewonnenes β-Glucan metabolisieren. Darüber hinaus Ba. vulgatus, Ba. uniformis, Bacova, BT, Dysgonomonas gadei, D. mossii und beide Baccell-Stämme konnten Hefe-β-Glucan nutzen. Es wurde zuvor gezeigt, dass Bacova auch in aus Gerste gewonnenem β-Glucan wächst34,35, was die breite Fähigkeit dieser Art zeigt, β-Glucane aus verschiedenen Quellen und chemischen Strukturen zu fermentieren (Abb. 1A). Abbildung 1B zeigt das Wachstumsprofil von Baccell WH2, Baccell DSMZ, BT und Bacova auf β-Glucan aus Mykoprotein (Abb. 1B). Zusätzlich zu diesen Wachstumsexperimenten untersuchten wir das Wachstum verschiedener Bifidobacterium-Stämme auf aus Mykoproteinen gewonnenem β-Glucan und zeigten deutlich, dass diese Stämme nicht in der Lage sind, diese komplexe Kohlenstoffquelle zu nutzen (Abb. S1A).

Um das Wachstum ausgewählter Bacteroides-Stämme auf bestimmten β-Glucanen weiter zu charakterisieren, führten wir eine Proteomikanalyse an Baccell WH2 durch, wenn es auf Glukose (als Referenz) oder aus Mykoproteinen stammendem Pilz-β-Glucan als Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde. Wir haben die generierten Proteomdaten dieses Bakteriums verglichen, wenn es auf einer dieser Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde, um Proteine ​​zu identifizieren, die eine erhöhte Expression zeigen, wenn der Stamm auf dem komplexen Polymer gezüchtet wird. Wie in Abb. 1C gezeigt, ergab diese Analyse, dass alle Proteine, die von zwei zugewiesenen GULs kodiert werden (hier als GUL-1 und GUL-2 bezeichnet und die Locus-Tags BcellWH2_01929-BcellWH2_01932 bzw. BcellWH2_02537-BcellWH2_02542 darstellen, siehe Abb. 1D), einen Anstieg aufweisen Expression, wenn Baccell WH2 auf dem Mykoprotein-abgeleiteten Pilz-β-Glucan-Metabolismus gezüchtet wurde (im Vergleich zum Wachstum auf Glucose). GUL-1 was predicted to encode two GH3 enzymes (BcellWH2_01926 and BcellWH2_01927) and a GH157 member (BcellWH2_01931), while the proteins encoded by locus tags BcellWH2_01928 and BcellWH2_01929 represent the SusC/D-like pair predicted to be involved in (polysaccharide) substrate Bindung und Erkennung an der Bakterienzelloberfläche (Abb. 1D). Darüber hinaus wird angenommen, dass BcellWH2_01932 das Hybrid Two Component System (HTCS)-Sensorsystem darstellt, das die Transkriptionsregulation von GUL-1 steuert. GUL-2 kodiert für ein GH30_3 (BcellWH2_02537, eine gemäß der CAZY-Datenbank vorhergesagte Endo-β-1,6-Glucanase), ein GH2 (BcellWH2_02541) und ein Protein ohne bekannte Funktion (BcellWH2_02538). Zusätzlich zu diesen Proteinen stellen BcellWH2_02539 und BcellWH2_02540 das vorhergesagte SusC/D-Paar in GUL2 dar (Abb. 1D). Um die Proteomikdaten zu bestätigen, haben wir Baccell WH2 bis zur Mitte exponentiell wachsen lassen und eine RT-qPCR an ausgewählten SusC/D-Paaren durchgeführt, die in den oben beschriebenen GULs identifiziert wurden (Abb. S1B). Darüber hinaus verwendeten wir diesen Ansatz auch mit BT und Bacova für die SusC/D-Paare, die auf der Grundlage unterschiedlicher Expressionsmuster identifiziert wurden, als diese beiden Stämme auf Beta-Glucan aus Pustulan gezüchtet wurden17,34,35 (Abb. S1B). Da wir eine unterschiedliche Expression basierend auf RT-qPCR beobachteten, scheint es, dass ihre entsprechenden GULs, die sich hinsichtlich ihrer genetischen Struktur und ihres Inhalts erheblich von denen von Baccell WH2 unterscheiden, auch für das Wachstum auf Pilz-β-Glucan verantwortlich sind. Abbildung 1D und S1C zeigen die GUL-Architektur von BT, Bacova und Baccell WH2 sowie vorhergesagte Funktionen im Zusammenhang mit der GUL-Regulierung, dem β-Glucan-Abbau und der damit verbundenen Oligosaccharidaufnahme. BT und Baccell WH2 verwenden eine andere GUL-Architektur für die Nutzung von β-Glucan aus Pilzen (Abb. 1D), im Vergleich zu Bacova, das aufgrund seines Expressionsprofils anscheinend dasselbe GUL für β-Glucan aus Pilzen und Gerste verwendet. S1B und S1C.

Wie oben erwähnt, können BT, Baccell WH2 und Bacova Pilz-β-Glucan verstoffwechseln. Basierend auf einer qPCR, die an BT durchgeführt wurde, das in einem Medium wächst, das entweder pilzliches β-Glucan oder Pustulan enthält, scheint dieses Bakterium für jede dieser beiden Kohlenstoffquellen denselben GUL zu verwenden17 (BT3309-BT3314, Abb. 1D und S1B). Laut qPCR-Daten, die erhalten wurden, als Bacova in einem Medium gezüchtet wurde, das entweder mit Gerste oder Pilz-β-Glucan angereichert war (Abb. S1B), wurde gezeigt, dass das Bakterium für jede dieser Kohlenstoffquellen den gleichen GUL verwendet, was im Gegensatz zu dem steht, was wir herausgefunden haben Baccell WH2, da dieses Bakterium offenbar unterschiedliche GULs verwendet, um entweder Pilz- oder Gersten-β-Glucan abzubauen (Abb. 1D und S1C)49.

Nach unserer Beobachtung, dass bestimmte Proteine, die von GUL-1 und GUL-2 von Baccell WH2 kodiert werden, und ihre entsprechenden Gene, die in GUL-1 und GUL-2 von Baccell WH2 vorhanden sind, beim Wachstum auf Pilz-β-Glucan eine erhöhte Expression hervorrufen, wollten wir ihre Beteiligung an diesem Stoffwechselprozess bestätigen. Zu diesem Zweck exprimierten wir rekombinant die Enzyme, die die mutmaßlichen GH157-, GH30_3- und GH3-Aktivitäten (Baccell WH2_01926) von GUL1/GUL2 repräsentieren, um den Mechanismus des Abbaus dieser komplexen Nahrungskohlenstoffquelle vollständig zu analysieren. Zu diesem Zweck inkubierten wir die exprimierten Proteine ​​mit pilzlichem β-Glucan und zeigten mögliche Abbauprodukte mittels HPLC-Chromatographie auf. Genauer gesagt zeigt Abb. 2A die HPLC-Chromatogramme von BcellWH2_01931 und BcellWH2_02537 (die die vorhergesagten GH157- bzw. GH30_3-Aktivitäten darstellen), die auf Pilz-β-Glucan wirken.

Alle HPLC-Experimente wurden in 3 verschiedenen unabhängigen Replikaten durchgeführt (n = 3). Ein Zeitverlauf von BcellWH2_01931 (GH157) mit Mykoprotein β-Glucan. B Zeitverlauf von BcellWH2_01931 (GH157) mit linearem β-1,3-Glucan. C Zeitlicher Verlauf von BcellWH2_02537 (GH30_3) auf dem Mykoprotein β-Glucan. D Zeitverlauf von BcellWH2_02537 (GH30_3) mit Pustulan. E Zeitverlauf von BcellWH2_01931 (GH157) und BcellWH2_02537 (GH30_3) zusammen auf linearem β-1,3-Glucan. F HPLC von BT3312 (GH30_3) auf Mykoprotein β-Glucan. G HPLC von BT3314 (GH3) auf Mykoprotein β-Glucan.

Die in Abb. 2A und 2B dargestellten Daten bestätigten, dass BcellWH2_01931 auf Pilz-β-Glucan (Abb. 2A) und das lineare β-1,3-Glucan aus Euglena glacialis (Abb. 2B) wirkt und zunächst Penta- und Trisaccharide freisetzt bei längerer Inkubation (16 h) in Disaccharide und Glucose umgewandelt. Allerdings fanden wir keine Aktivität, als das Enzym mit Pustulan inkubiert wurde. Tabelle 1 listet die kinetischen Parameter (kcat/Km) dieses Proteins auf, das auf jedes Substrat wirkt.

Um die Vorhersage zu bestätigen, dass diese Enzyme am β-Glucan-Metabolismus von Pilzen beteiligt sind, führten wir eine Proteinlokalisierungsanalyse mit LipoP50 durch, die darauf hinweist, dass sich BcellWH2_01931 (GH157) und BcellWH2_02537 (GH30_3) auf der Zelloberfläche von Baccell WH2 befinden. Darüber hinaus wurde laut der CAZY-Datenbank erwartet, dass das Enzym GH157 als Endo-β-1,3-Glucanase fungiert, während erwartet wurde, dass das Enzym GH30_3 eine Endo-β-1,6-Glucanase-Aktivität besitzt, wie bereits berichtet wurde andere Mitglieder dieser CAZY-Familie17. Wie GH157 wurde rekombinant exprimiertes und gereinigtes GH30_3 mit Pilz-β-Glucan, linearem β-1,3-Glucan und Pustulan (lineares β-1,6-Glucan) inkubiert, gefolgt von einer HPLC-Analyse. Abbildung 2C und 2D zeigen die zugehörigen Chromatographieergebnisse für dieses Inkubationsexperiment und bestätigen die β-1,6-Glucanase-Aktivität mit Pilz-β-Glucan (Abb. 2C) und Pustulan (Abb. 2D). Darüber hinaus zeigte GH30_3 keine Aktivität gegen lineares β-1,3-Glucan. Tabelle 1 zeigt die katalytischen Parameter dieses Proteins, gemessen durch DNSA-Assays mit Pilz-β-Glucan und Pustulan. BcellWH2_02537 zeigte Aktivitätsparameter für β-Glucan aus Fusarium venenatum, die denen für Pustulan ähneln (kcat/Km von 2512 ± 28 und 1968 ± 17 mg ml−1 min−1), was darauf hindeutet, dass das Enzym keine Wechselwirkungen mit dem β-Glucan erfordert. (1,3)-Glucan-Rückgrat. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BcellWH2_02537 nur Aktivität bei Oligosacchariden aufweist, die größer als β-(1,6)-Glucotriose sind, was darauf hindeutet, dass das Enzym wie bei BT3312 drei Unterstellen im aktiven Zentrum aufweist (Nomenklatur von Davies et al. festgelegt)51.

Um schließlich vollständig zu verstehen, wie aus Mykoproteinen gewonnenes β-Glucan von Baccell WH2 metabolisiert wird, haben wir die vorhergesagten GH3- und GH2-Enzyme (wie durch BcellWH2_01926 bzw. BcellWH2_02541 spezifiziert) rekombinant exprimiert und gezeigt, dass beide in der Lage sind, auf die verschiedenen produzierten Oligosaccharide einzuwirken durch die Wirkung der Enzyme GH157 und GH30_3. BcellWH2_01926 (GH3) war in der Lage, von GH30_3 freigesetzte β-1,6-Glucooligosaccharide abzubauen, während gezeigt wurde, dass das GH2-Enzym (BcellWH2_02541) auf β-1,3-Glucooligosaccharide (Glucobiose und Glucotriose) einwirkt und in beiden Fällen Glucose freisetzt das Endprodukt, das den exo-wirkenden Mechanismus für diese Enzyme bestätigt (BcellWH2_01926 und BcellWH2_02541). Tabelle 1 zeigt auch die katalytischen Parameter dieser beiden Exoglucosidasen, was verdeutlicht, dass die Aktivität des GH2-Enzyms für β-1,3-Glucobiose und β-1,3-Glucotriose ähnlich ist, was auf zwei Unterstellen im aktiven Zentrum schließen lässt.

Im Fall von BT ist die GUL-Architektur einfacher als die für Baccell WH2 beobachtete (Abb. 1D). Für das erstere Bakterium wurde bisher nur beschrieben, dass GH30_3 (BT3312) und ein GH3 (BT3314) auf Pustulan-β-Glucan aktiv sind17. Um die katalytische Aktivität von BT3312 auf β-Glucan aus Fusarium venenatum zu bewerten, führten wir enzymatische Tests mit diesem Polysaccharid durch und erzielten Aktivitätswerte, die denen von BcellWH2_02537 ähneln (2874 ± 35 mg ml−1 min−1 für BT3312 und 2512 ± 28 mg). ml−1 min−1 für BcellWH2_02537) (Tabelle 1). Es wurde gezeigt, dass das BT3312-Enzym an den β-Glucan-Seitenketten von Pilzen aktiv ist und dadurch bestimmte β-1,6-Oligosaccharide freisetzt, die wiederum von BT3314 als Exo-Glucosidase hydrolysiert werden können, um Glukose freizusetzen (Abb. 2F für BT3312, und Abb. 2G für BT3314). Wie bei den Baccell WH2-Enzymen zeigt Tabelle 1 die katalytischen Parameter für BT3312 und BT3314 auf diesen Substraten.

Um die Wechselwirkungen der Baccell WH2-kodierten GH157- und GH30_3-Enzyme mit Pilz-β-Glucan zu untersuchen, haben wir versucht, Kristalle der Baccell WH2-Proteine ​​zu erhalten. Leider konnten wir trotz der Prüfung mehrerer Bedingungen keine geeigneten Kristalle erhalten. Stattdessen erhielten wir die Struktur des GH30_3-Proteins durch Vergleich mit der für BT3312 gelösten Kristallstruktur unter Verwendung des Phyre2-Algorithmus als Suchplattform17,52. Abb. S1D zeigt, dass die vorhergesagte Struktur ein (β/a)8-Fass mit dem konservierten Haltemechanismus ist, bei dem zwei Glutaminsäuren als Nukleophil (E339 und E347 für BT3312 bzw. BcellWH2_02537) und Säure/Base (E238 und E247 für BT3312) fungieren bzw. BcellWH2_02537). Wie in dieser Abbildung gezeigt, weisen beide Proteine ​​ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit auf (58,33 % identisch) und weisen das gleiche Aktivitätsprofil auf (Tabelle 1). Dies weist darauf hin, dass GH30_3 von Baccell WH2 nur drei Hauptunterstandorte enthält, ähnlich wie für BT331217 beschrieben. An der Bindung und Katalyse beteiligte Aminosäuren sind in beiden Proteinen konserviert (Abb. S1E).

Um zu untersuchen, ob Baccell WH2 und BT Oligosaccharide in ihr Kultivierungsmedium freisetzen, wenn sie auf pilzlichem β-Glucan gezüchtet werden, und dadurch möglicherweise das Wachstum anderer Bakterien durch Cross-Feeding-Aktivitäten ermöglichen, haben wir nach der Kultivierung dieser Stämme bis zur Mitte der Exponentialaktivität zellfreies Wachstumsmedium erhalten und stationäre Phase (Abb. 3). Das Vorhandensein von Oligosacchariden, die von Baccell WH2 oder BT in das Medium freigesetzt wurden, wurde dann durch HPLC beurteilt (Abb. 3A, B). Wenn diese beiden Bakterienarten Mykoprotein als einzige Kohlenstoffquelle verwenden (Abb. 3A), geben sie nachweislich Oligosaccharide in das Medium ab, diese waren jedoch jeweils unterschiedlich (Abb. 3B), was mit ihrer unterschiedlichen GUL-Architektur übereinstimmt assoziierte Enzyme, was die unterschiedliche Abbaustrategie jeder dieser beiden Arten bestätigt.

Ein HPLC-Chromatogramm des Wachstumsmediums von Baccell WH2 auf Pilz-β-Glucan. B Wie Panel A mit BT. C Gereinigtes Oligosaccharid aus Baccell WH2 nach der Gelfiltrationssäule (GF). D Gereinigtes Oligosaccharid von BT nach GF-Säule. E LC/MS des auf Pilz-β-Glucan gewachsenen Baccell WH2-Überstands. F LC/MS des auf Pilz-β-Glucan gewachsenen BT-Überstands. Alle HPLC- und LC/MS-Experimente wurden in drei verschiedenen unabhängigen Replikaten durchgeführt (n = 3).

Um die Natur dieser Oligosaccharide zu untersuchen, führten wir LC/MS durch, um ihre Masse zu bestimmen. Abbildung 3C zeigt das HPLC-Profil des gereinigten Hauptoligosaccharids, das von Baccell WH2 freigesetzt wird, und Abbildung 3E das zugehörige Massenspektrum dieses Oligosaccharids, das bestätigt, dass dieses Bakterium überwiegend ein Heptasaccharid freisetzt. Diese Ergebnisse stimmen mit der enzymatischen In-vitro-Verdauung von pilzlichem β-Glucan überein, denn als wir diese pilzliche Kohlenstoffquelle mit GH30_3 und GH157 zusammen inkubierten, waren die von beiden Enzymen erzeugten Produkte Glucose, 1,6-β-Glucobiose 1,3- β-Glucotetraose und das Heptasaccharid, das im von Baccell WH2 erzeugten Wachstumsmedium vorhanden ist (Abb. 2E). Abbildung 3F zeigt die Massenspektren der von BT im Wachstumsmedium freigesetzten Hauptoligosaccharide und bestätigt das Vorhandensein eines Disaccharids als Hauptprodukt, das 1,6-β-Glucobiose entspricht, wie im HPLC-Chromatogramm angegeben (Abb. 3D). .

Nachdem wir die Freisetzung von Oligosacchariden in das Wachstumsmedium durch Bacteroides beim Wachstum auf Mykoprotein β-Glucan bestätigt hatten, stellten wir die Hypothese auf, dass dieses Phänomen es anderen Darmkommensalen ermöglichen würde, sich von solchen freigesetzten Oligosacchariden zu ernähren.

Tatsächlich zeigt Abb. 4, dass Bifidobacterium-Stämme wachsen können, wenn sie zusammen mit Bacteroides auf pilzlichem β-Glucan kultiviert werden. Wir haben den Übernachtüberstand von Baccell WH2 und BT, die in β-Glucan gezüchtet wurden, mit mehreren verfügbaren Bifidobacterium- und Lactobacillus-Stämmen gescreent und dabei gezeigt, dass im Fall des Baccell WH2-Überstands Bi. breve UCC2003, Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 und Lb. plantarum WCFS1 sind nicht in der Lage, intaktes β-Glucan als Kohlenstoffquelle zu nutzen, können jedoch das von Baccell WH2 freigesetzte Heptasaccharid nutzen (Abb. 4A). Wir haben die Fähigkeit dieser Stämme, das Heptasaccharid zu verwenden, durch Tests der Wachstumsmedien vor und nach dem Bi bestätigt. breve UCC2003, Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 und Lb. plantarum WCFS1-Wachstum. Abbildung 4B bestätigt die Verwendung des Heptasaccharids durch Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809, mit Bi. breve UCC2003 und Lb. plantarum WCFS1 zeigt auch eine bescheidenere Fähigkeit, das freigesetzte Oligosaccharid zu nutzen. Nach 24 h Gärung, Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 erreichte bei Verwendung des Überstands von Baccell WH2 eine endgültige optische Dichte von 0,8. Bi. breve und Lb. plantarum konnten diese Oligosaccharide nutzen, jedoch in geringerem Maße, und erreichten eine endgültige optische Dichte von 0,6.

Ein Wachstum von Bifidobacterium mit Pilz-β-Glucan-Überstand von Baccell WH2. B HPLC-Analyse der Überstände vor und nach dem Wachstum von Bifidobacterium longum subsp. longum auf Überständen von Baccell WH2. C Wachstum von Bifidobacterium mit Pilz-β-Glucan-Überstand von BT. D HPLC-Analyse von Überständen vor und nach dem Wachstum von Bifidobacterium longum subspezie longum auf zellfreiem Überstand von BT, gewachsen auf Pilz-β-Glucan. E HPLC-Analyse von Überständen vor und nach dem Wachstum von Bi breve UCC2003 und L. plantarum auf zellfreien Überständen von BT, die auf Pilz-β-Glucan gezüchtet wurden. Alle Wachstums- und HPLC-Experimente wurden in 3 verschiedenen unabhängigen Replikaten durchgeführt (n = 3).

Als der Überstand von BT als Kohlenstoffquelle für das Bi-Screening verwendet wurde. breve UCC2003, Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 und Lb. plantarum WCFS1, das Disaccharid, das sich sonst im Medium ansammelt, ist jetzt nicht mehr vorhanden, was darauf hinweist, dass diese β-1,6-Glucobiose von den Bifidobakterien- und Lactiplantibacillus-Stämmen verwendet wird, um ihr Wachstum aufrechtzuerhalten (Abb. 4C, D). Eine Analyse des Wachstumsmediums mittels HPLC wurde auch für Bi durchgeführt. breve UCC2003 und Lb. plantarum WCFS1, was ihre Fähigkeit bestätigt, die β-1,6-Glucobiose als Kohlenstoffquelle zu nutzen (Abb. 4E).

Um diese neu entdeckte Kreuzfütterungsinteraktion zwischen Bacteroides- und Bifidobacterium-Arten zu bestätigen, führten wir Kreuzfütterungsexperimente zu verschiedenen Zeitpunkten durch, bei denen wir eine Co-Kultur beider Arten überprüften, die koloniebildenden Einheiten verfolgten und jeweils eine 16 S rRNA-basierte qPCR-Quantifizierung durchführten Arten während des Wachstums (Abb. 5, 6). In diesem Co-Kultur-Experiment erlaubte Baccell WH2 Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 und Bi. breve UCC2003 wächst, wenn beide Stämme mit dem intakten pilzlichen β-Glucan kultiviert werden, wie aus der Bewertung der lebensfähigen Anzahl (Abb. 5A für Bi. longum subsp. longum und 5 C für Bi. breve) und dem prozentualen Anteil beider Bakterien in der Co. hervorgeht -Kultur (Abb. 5B für Bi. longum subsp. longum und 5D für Bi. breve). Die Beobachtung des Bifidobacterium-Wachstums bei Co-Kultur mit Baccell WH2 in Gegenwart von β-Glucan stimmte mit den Ergebnissen der Monokultur-Fermentation überein, als zellfreier Überstand als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, wie in Abb. 4 dargestellt.

Eine Kolonie, die Einheiten von Baccell WH2 + Bi bildet. longum subsp. longum. B Prozentsatz von Baccell WH2 + Bi. longum subsp. longum. C Koloniebildende Einheiten von Baccell WH2 + Bi. Breve UCC2003. D Prozentsatz von Baccell WH2 + Bi. Kürze UCC2003. Alle Kreuzfütterungsexperimente wurden in 3 verschiedenen unabhängigen Wiederholungen durchgeführt (n = 3).

Eine Kolonie, die Einheiten von BT + Bi bildet. Kürze UCC2003. B Prozentsatz von BT + Bi. Kürze UCC2003. C Koloniebildende Einheiten von BT + Bi. longum subsp. longum. D Prozentsatz von BT + Bi. longum subsp. longum. Alle Kreuzfütterungsexperimente wurden in 3 verschiedenen unabhängigen Wiederholungen durchgeführt (n = 3).

In ähnlicher Weise ermöglichte BT das Wachstum von Bi. breve UCC2003 und Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 in Co-Kultur, wie in den Abbildungen zu sehen ist. 6A und 6C (koloniebildende Einheiten) bzw. 6B und 6D (Prozentsatz). Es bestätigte erneut die Fähigkeit von Bacteroides, spezifische Kreuznahrungsnetzwerke mit Bifidobacterium-Stämmen im Darm zu ermöglichen, wenn die ersteren Bakterien auf Nahrungspilz-β-Glucan wachsen.

Um diese Studie schließlich mit anderen kommensalen Mitgliedern der menschlichen Darmmikrobiota zu erweitern, führten wir das Co-Kulturexperiment von Baccell WH2 und BT als primärem und Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 als sekundärem Abbauer durch, um die Fähigkeit von Baccel WH2 und BT, Wachstum zu ermöglichen, zu bestätigen dieses Kommensals. Feigen. S2A und S2B für Baccell WH2 und Abb. S2C und S2D für BT zeigten diese Fähigkeit auch in der Co-Kultur.

Wie oben erwähnt, Bi. breve UCC2003 kann Glucobiose nutzen, die von Baccell WH2 freigesetzt wird, wenn es auf β-Glucan gezüchtet wird. Wir haben eine bioinformatische Analyse des Genoms des ehemaligen Bakteriums durchgeführt, um Glykosidhydrolasen zu identifizieren, die es Bifidobacterium ermöglichen würden, dieses Oligosaccharid zu nutzen. Wir haben ein GH1 (Bbr_0109) identifiziert, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es auf Cellobiose als Substrat53 wirkt. Wir stellten die Hypothese auf, dass dieses Protein auf Gluco-Oligosaccharide mit unterschiedlichen Bindungen als Substrate einwirken würde. Um unsere Hypothese zu beweisen, exprimierten wir das Protein rekombinant und führten enzymatische Tests mit β-1,4-, β-1,3- und β-1,6-Glucobiose als Substraten des Enzyms durch. Bbr_0109 war erwartungsgemäß auf β-1,4- und β-1,6-Glucobiose aktiv, und diese Aktivität wird durch HPLC in den Abbildungen gezeigt. S3A bzw. S3B. Darüber hinaus konnten wir diese Aktivität charakterisieren und die kinetischen Parameter sind in Tabelle 1 berechnet. Bioinformatische Analyse des Bi. longum subsp. Das longum-Genom zeigte kein Homolog von Bbr_0109 oder anderen Kandidatenenzymen, die für seine Fähigkeit zur Kreuzernährung mit von β-Glucan abgeleiteten Oligosacchariden verantwortlich sind. Daher sind weitere Arbeiten erforderlich, um den für diese Aktivität verantwortlichen Stoffwechselweg zu entschlüsseln.

Nachdem wir die Fähigkeit von Bacteroides bestätigt hatten, das Wachstum von Bifidobacterium spezifisch zu ermöglichen, wenn das ehemalige Bakterium auf β-Glucan kultiviert wird, führten wir eine Metabolomik-Analyse des Kulturmediums durch, um die Produktion kurzkettiger Fettsäuren (SCFA)/Laktat/Succinat durch Bacteroides und Bifidobacterium zu bewerten in Mono- und Co-Kulturen. Tabelle 2 listet die durch diese Fermentationen nachgewiesenen Mengen an Acetat, Butyrat, Propionat und Laktat auf. Es wurde gezeigt, dass Baccell WH2 Succinat (78 mM) und Acetat (12 mM) als Haupt-SCFAs produziert, die in Monokultur produziert werden. Als Kontrolle, Bi. longum subsp. longum NCIMB 8809 konnte aufgrund seiner Unfähigkeit, das intakte Mykoprotein β-Glucan zu nutzen, keine nennenswerten Mengen an SCFAs produzieren. Im Gegensatz dazu war in der Co-Kultur Acetat die höher konzentrierte SCFA (115 mM), gefolgt von Succinat (99 mM) als Folge der subsp. longum NCIMB 8809 Wachstum. Schließlich wurden aufgrund der Fähigkeit von Bifidobacterium, diese Metaboliten zu produzieren, auch Formiat (16 mM) und Laktat (21 mM) in der Co-Kultur produziert.

Es wurde bereits nachgewiesen, dass β-Glucan als präbiotisches Kohlenhydrat wirkt und verschiedene positive Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit hat54,55,56,57. Kürzlich haben Dejean et al. (2020) zeigten die Fähigkeit von Bacteroides-Stämmen, β-(1,3)-Glucane zu nutzen, wie sie beispielsweise aus Hefe oder Algen-Laminarin stammen13. Diese Autoren zeigten, dass Bacteroides uniformis ATCC 8492 einen spezifischen Polysaccharid-Nutzungsort für den Abbau dieser β-(1,3)-Glucane nutzt. Dieser genetische Ort kodiert für ein zelloberflächenassoziiertes Enzym der Glycosidhydrolase-Familie 158 (GH158) und ein GH16, um die Depolymerisation des Polysaccharids einzuleiten und Oligosaccharide freizusetzen, die vom SusC/D-ähnlichen Paar in das Periplasma eingebaut werden, wo eine GH3 (β-Glucosidase) entsteht ) setzt den Abbauprozess fort, bei dem alle Oligosaccharide in Glucosemonomere umgewandelt werden, die dann in den zentralen glykolytischen Katabolismus eintreten. Ebenfalls im Jahr 2020 zeigten Singh et al.37 die Fähigkeit von Bacteroides uniformis JCM 13288, β-(1,3)-Glucane mit einem ähnlichen enzymatischen Mechanismus wie der oben erwähnte Stamm Bacteroides uniformis abzubauen. Diese letztgenannten Autoren zeigten jedoch eine zusätzliche GH30-Aktivität, die in der Lage ist, β-(1,6)-Glucan-Seitenketten des Moleküls abzubauen, wodurch β-1,6-Glucobiose freigesetzt wird. Darüber hinaus zeigten sie, dass die von diesem Ba freigesetzten Oligosaccharide. Der Stamm uniformis kann von anderen Mitgliedern der Darmmikrobiota verwendet werden, die unter Laminarin entweder nicht oder nur schlecht gewachsen sind.

Im Fall von Gersten-β-Glucan zeigten Tamura et al.34,35,36, dass Bacova und Baccell WH2 ein oberflächenassoziiertes GH16-Enzym (Bovatus_03149 und BcellWH2_04354) verwenden, um den Abbauprozess einzuleiten. Darüber hinaus zeigten dieselben Autoren, dass im Periplasma von Bacova zwei GH3-Enzyme (Bovatus_03146 ​​und Bovatus_03153) und eines im Periplasma von Baccell WH2 (BcellWH2_4356) vorhanden sind, um den Metabolismus von Gersten-β-Glucan zu vervollständigen.

In der hier beschriebenen Arbeit zeigen wir einen alternativen Weg auf, dem Baccell WH2 folgt, um β-Glucane aus Nahrungspilzen abzubauen, wie zum Beispiel das Polysaccharid aus Fusarium venenatum, dem Hauptbestandteil von Quorn®-Produkten, dessen chemische Struktur aus einem linearen β besteht -(1,3)-Glucan-Rückgrat mit β-(1,6)-Glucan als Seitenketten (Abb. 1A). Für diesen Stoffwechsel verwendet Baccell WH2 zwei GULs, um dieses komplexe Glykan abzubauen, wie durch Proteomik nachgewiesen und durch Transkriptomik bestätigt (Abb. 1C bzw. S1B). Innerhalb dieser GULs kodiert Baccell WH2 ein neuartiges GH157 und ein GH30_3, die sich beide voraussichtlich an der Zelloberfläche befinden und den Abbau des komplexen Glykans in Gang setzen. Es wurde auch gezeigt, dass diese GULs zusätzliche Glycosidhydrolasen kodieren, die zum vollständigen Abbau der Gluco-Oligosaccharide erforderlich sind, die von den Oberflächenproteinen der äußeren Membran freigesetzt und von den SusC/D-ähnlichen Paaren in das Periplasma eingebaut werden. Diese periplasmatischen Proteine ​​stellen typische β-Glucosidasen dar, die zu den GH-Familien 3 und 2 gehören. Schließlich kodiert dieser GUL ein Protein mit einer unbekannten Funktion (BcellWH2_02538), dessen vorhergesagte Position sich auf der Oberfläche von Baccell WH2 befindet. Dieses Protein eignet sich perfekt als Oberflächenglycan-Bindungsprotein (SGBP), das nachweislich das SusC/D-ähnliche Paar bei der Bindung von Oligosacchariden an der Bakterienzelloberfläche unterstützt35,36,58. Der Grund für das Vorhandensein von drei verschiedenen β-Glucosidasen (zwei GH3 und eine GH2), die von diesen GULs kodiert werden, um auf pilzliches β-Glucan abzuzielen, bleibt für uns spekulativ. Wir gehen davon aus, dass Baccell WH2 auf verschiedene Arten von β-Glucanen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen einwirken könnte, nicht nur auf Pilzquellen. Aus diesem Grund verwenden sie unterschiedliche β-Glucosidasen, um verschiedene Bindungen in diesen Gluco-Oligosacchariden zu hydrolysieren. Allerdings können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass einige dieser β-Glucosidasen überflüssig sind und das Bakterium sich unter dem hohen Selektionsdruck der Darmumgebung dahingehend entwickelt, einige dieser Gene aus seinem Genom zu entfernen.

Schließlich zeigen wir, dass Baccell WH2 und BT Oligosaccharide mit anderen Mitgliedern der Darmmikrobiota teilen können, einschließlich der kommensalen Bifidobacterium- und Lactiplantibacillus-Arten. In dieser Hinsicht wurde gezeigt, dass Baccell WH2 Kreuzfütterungsinteraktionen mit Bi ermöglicht. longum subsp. longum, Bi. breve UCC2003 und Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Abb. 5 und S2). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BT eine spezifische Kreuzfütterung mit Bi fördert. longum subsp. longum, Bi. breve UCC2003 und Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Abb. 6 und S2), was das Wachstum beider Bakterien in Co-Kultur ermöglicht. Da die von BT und Baccell WH freigesetzten Oligosaccharide unterschiedlich sind (z. B. Glucoheptasaccharid und Glucobiose), werden spezifische Wechselwirkungen im Darm selektiert. Bi. Kurz gesagt: UCC2003 kodiert ein GH1 (Bbr_0109), um die von BT freigesetzte Glucobiose abzubauen. Dieses GH1 ist sehr spezifisch für Glucobiose und wirkt auf β-(1,3)Glucobiose, β-(1,4)Glucobiose und β-(1,6)Glucobiose (Tabelle 1). Allerdings könnte die Unfähigkeit, auf Glucotriose oder andere längere Oligosaccharide einzuwirken, die teilweise Fähigkeit von Bi erklären. breve, das von Baccell WH2 freigesetzte Heptasaccharid zu verwenden, und als Folge dessen Unfähigkeit, im Baccell WH2-Überstand zu wachsen. Diese spezifischen Wechselwirkungen bei der Kreuzernährung zwischen Bacteroides- und Bifidobacterium-Mitgliedern wurden für andere Polysaccharide wie Arabinogalactan31, Arabinoxylan48 oder Inulin59 gezeigt.

In Bezug auf β-Glucan wurde nur wenig über gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der Darmmikrobiota berichtet. Wie oben erwähnt, haben Singh et al.37 die Fähigkeit von Ba gezeigt. uniformis JCM 13288 teilt Gluco-Oligosaccharide mit Blautia producta JCM1471, Ruminococcus faecis JCM15917 und Bifidobacterium jugendlichis JCM 1275, wenn sie auf Laminarin als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Darüber hinaus zeigten Centanni et al.60 Wechselwirkungen zwischen Bacteroides ovatus, Subdoligranulum variabile und Hungatella hathewayi unter Verwendung von Gersten-β-Glucan als Kohlenstoffquelle. Sie zeigten, dass Ba. ovatus gab 3-O-β-Cellobiosyl-d-glucose und 3-O-β-Cellotriosyl-d-glucose als Endprodukte in das Medium ab und diese Oligomere ermöglichten das Wachstum der beiden anderen Bakterien mit Präferenz für 3-O-β- Cellotriosyl-d-glucose im Fall von Hungatella hathewayi. Nach unserem besten Wissen deckt unsere Studie jedoch zum ersten Mal detaillierte molekulare Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mitgliedern von Bacteroides spp. auf. und andere menschliche Kommensalen (Bifidobacterium und Lactiplantibacillus) bei Verwendung von pilzlichem β-Glucan.

Schließlich haben wir die Fähigkeit von Baccell und B. breve UCC2003 gezeigt, als Ergebnis der β-Glucan-Fermentation unterschiedliche SCFA in Mono- und Kokultur zu produzieren. Baccell produziert Acetat und Succinat als Hauptmetaboliten, wenn es in Monokultur auf β-Glucan wächst, wohingegen die gemeinsame Kultivierung mit B. breve UCC2003 nachweislich nicht nur zur Produktion von Acetat und Succinat, sondern auch Laktat und Formiat führt, letzteres aus der Bifidobacterium-Fermentation . Diese Produktion steht im Einklang mit anderen fermentativen Prozessen, bei denen Bacteroides Acetat als Haupt-SCFA produziert31. Munoz et al. haben über die Produktion von geringeren Mengen an Succinat (60 mM) bei der AGP-Fermentation berichtet als bei β-Glucan (78 mM, Tabelle 2), wenn Baccell in Monokulturen kultiviert wurde. Bei der Acetatproduktion wird jedoch der gegenteilige Effekt beobachtet, da Baccell nachweislich 24 mM und 12 mM Acetat produziert, wenn es auf AGP bzw. β-Glucan kultiviert wird31. Allerdings scheint die SCFA-Produktion für alle Metaboliten höher zu sein, wenn Baccell zusammen mit B. breve UCC2003 in Gegenwart von β-Glucan (115, 99, 21 und 16 mM für Acetat, Succinat, Lactat bzw. Formiat) kultiviert wurde. im Vergleich zur Co-Kultivierung in Gegenwart von AGP (94, 68, 6 und 6,9 mM für Acetat, Succinat, Lactat bzw. Formiat)31.

Alle in dieser Arbeit präsentierten Daten ermöglichten es uns, ein allgemeines Modell für den Abbau von Pilz-β-Glucan in Baccell WH2 und seine Wechselwirkung mit Bifidobakterien als sekundären Abbauern zu erhalten (Abb. S3C).

Zusammenfassend zeigt dieser Artikel die Fähigkeit verschiedener Bakterienstämme des menschlichen Darms, β-Glucan aus Nahrungspilzen zu nutzen. Wir haben gezeigt, dass Bacteroides zwei Haupt-GULs verwendet, um dieses komplexe Glykan mit neuartigen enzymatischen Aktivitäten und Familien abzubauen, die in diesen GULs entdeckt wurden, und dass sie Oligosaccharide und Bi gemeinsam haben. longum subsp. longum und Bi. Breve UCC2003 selektiv, wo sie verwendet werden können. Schließlich haben wir das spezifische Enzym (Bbr_0109, GH1) gezeigt, das in Bi kodiert ist. breve UCC2003 ist für den Abbau des von BT freigesetzten Oligosaccharids verantwortlich. Somit liefert die Studie Hinweise darauf, dass pilzliche β-Glucan-Verwertungsgene nicht nur in Bacteroides, sondern auch in grampositiven Bakterien vorhanden sind. Verschiedene in dieser Studie identifizierte β-Glucan-GULs könnten den Weg für die Entwicklung technischer funktioneller Lebensmittel zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit durch geeignete Ernährungsinterventionstherapie ebnen.

Das in dieser Studie getestete Hefe- und Gersten-β-Glucan wurde von Megazyme (Dublin, Irland) gekauft. D-Galactose und D-Glucose wurden von Sigma (Großbritannien) bezogen. Das Wachstumsmedium Luria-Bertani (LB) wurde von Formedium (Norfolk, UK), verstärktes Clostridien-Agar von Oxoid Ltd. (Basingstoke, England) und Brain Heart Infusion von Sigma (Großbritannien) gekauft. Alle Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Zellwandmaterial aus Fusarium venenatum wurde extrahiert und die verschiedenen Glykanteile wurden gemäß einer zuvor beschriebenen Methode61 gereinigt. Kurz gesagt, Zellwandmaterial wurde 75 Stunden lang mit 3 % NaOH alkalisch extrahiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden: Fraktion 1, löslich in Basen, und Fraktion 2, unlöslich in Basen. Es wurde gezeigt, dass Fraktion 1 Mannoproteine ​​und β-1,6-1,3-Glucan enthielt und die Fraktionen dieses β-1,6-1,3-Glucan in Verbindung mit Chitin enthielten. Fraktion 1 wurde mit Eisessig neutralisiert und 30 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert und der Überstand einer 24-stündigen Dialyse unterzogen. Nach der Dialyse wurde die Mischung vor ihrer Verwendung gefriergetrocknet (Abb. S4A, B).

Ba. ovatus ATCC8483 (Bovatus), Ba. thetaiotaomicron VPI-5482 (BT), Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSM) und Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) können auf allen in dieser Studie interessierenden Kohlenstoffquellen wachsen und wurden daher direkt in 3 ml Minimal Media (MM) mit 1 % (Gew./Vol.) Kohlenhydraten kultiviert, wie oben beschrieben48.

Bacteroides sp. wurden auf MM + Glucose vorkultiviert, pelletiert, gewaschen, zweimal in MM ohne Kohlenstoffquelle resuspendiert und in 4 ml MM mit 1 % (Gew./Vol.) Kohlenhydraten auf einen A600-Wert von ~0,3 beimpft. Bakterienkulturen wurden dreifach geerntet (in der mittleren Log-Phase [A600, ~0,6] nach 5-stündiger Inkubation für Bovatus, BT, Baccell DSM und Baccell WH2, zur sofortigen Stabilisierung der RNA in RNA Protect (Qiagen) gegeben und dann gelagert bei –20 °C. RNA wurde mit dem RNeasy Minikit (Qiagen) extrahiert und gereinigt und die RNA-Reinheit wurde durch Spektrophotometrie bewertet. Ein µg RNA wurde für die reverse Transkription und Synthese der cDNA (SuperScript VILO Master Mix; Invitrogen) verwendet. Quantitative PCRs (20 µl Endvolumen) unter Verwendung spezifischer Primer wurden mit einem SensiFast SYBR Lo-ROX-Kit (Bioline) auf einem 7500 Fast Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt (Tabelle S2). Die Daten wurden auf 16 S rRNA-Transkript normalisiert Die Konzentrationen und Veränderungen der Expressionsmengen wurden als fache Veränderung im Vergleich zu den Konzentrationen für glukosehaltige MM-Kulturen berechnet.

Baccell WH2 wurde auf die gleiche Weise wie zuvor mit 1 % β-Glucan als komplexem Polysaccharid und Glucose als Monosaccharidkontrolle kultiviert. Bakterienkulturen wurden nach Wachstum in MM+Glc oder MM+β-Glucan dreifach geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3.500 g, 15 Min., 4 °C) gesammelt und dreimal mit PBS pH 7,4 gewaschen. Zellpellets wurden anschließend in 8 M Harnstoffpuffer in 50 mM Triethylammoniumbicarbonat, enthaltend 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin, resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung mit einem Ultraschallhomogenisator (Hielscher) lysiert. Anschließend wurden die Proteine ​​30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 mM Iodacetamid im Dunkeln alkyliert. Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines Bradford-Proteinassays (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Proteinproben, die 50 μg Gesamtprotein enthielten, wurden fünffach mit 50 mM Triethylammoniumbicarbonat verdünnt und der Proteinverdau wurde 18 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei 300 U/min durchgeführt. Es wurde ein Protein-Trypsin-Verhältnis von 50:1 verwendet. Der Trypsinverdau wurde gestoppt und die Peptide wurden wie oben beschrieben entsalzt.

Die Peptide wurden in 2 % Acetonitril mit 0,1 % Trifluoressigsäure gelöst und jede Probe wurde unabhängig auf einem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert, das an ein UltiMate 3000 RSLCnano-System (Thermo Fisher Scientific) angeschlossen war. Die Peptide wurden auf einer Acclaim PepMap 100 C18 LC-Trap-Säule (100 μm ID × 20 mm, 3 μm, 100 Å) injiziert, gefolgt von der Trennung auf einer EASY-Spray nanoLC C18-Säule (75 ID μm × 500 mm, 2 μm, 100 Å). bei einer Durchflussrate von 300 nlmin−1. Lösungsmittel A war Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und Lösungsmittel B war 80 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure. Der für die Analyse von oberflächenrasierten Proben verwendete Gradient war wie folgt: Lösungsmittel B wurde 6 Minuten lang bei 3 % gehalten, gefolgt von einem Anstieg von 3 auf 35 % B in 43 Minuten, 35–90 % B in 0,5 Minuten, gehalten bei 90 % B für 5,4 Minuten, gefolgt von einem Abfall auf 3 % in 0,1 Minuten und einer Äquilibrierung bei 3 % für 10 Minuten. Der für die Analyse von Proteomproben verwendete Gradient war wie folgt: Lösungsmittel B wurde 6 Minuten lang bei 3 % gehalten, gefolgt von einem Anstieg von 3 auf 35 % B in 218 Minuten, 35–90 % B in 0,5 Minuten, gehalten bei 90 % B für 5 Minuten, gefolgt von einer Abnahme auf 3 % in 0,5 Minuten und einer Äquilibrierung bei 3 % für 10 Minuten. Der Orbitrap Fusion Lumos wurde im datenabhängigen Modus positiver Ionen unter Verwendung einer modifizierten Version der kürzlich beschriebenen Methode der ladungsgeordneten parallelen Ionenanalyse (CHOPIN) zur synchronisierten Verwendung sowohl der Ionenfalle als auch der Orbitrap-Massenanalysatoren betrieben. Die CHOPIN-Methode ist von der von Thermo-Fisher entwickelten „Universal-Methode“ abgeleitet, um die Möglichkeiten der Parallelisierung von Massenanalysatoren zu erweitern. Der Vorläuferionenscan (vollständiger Scan) wurde im Orbitrap im Bereich von 400–1600 m/z mit einer Auflösung von 120.000 bei 200 m/z, einem automatischen Verstärkungskontrollziel (AGC) von 4 × 105 und einer Ioneninjektion durchgeführt Zeit von 50 ms. MS/MS-Spektren doppelt geladener Vorläuferionen wurden in der linearen Ionenfalle (IT) im Schnellscanmodus nach kollisionsinduzierter Dissoziationsfragmentierung (CID) aufgenommen. Es wurde eine CID-Kollisionsenergie von 32 % verwendet, das AGC-Ziel auf 2 × 103 eingestellt und eine Injektionszeit von 300 ms zugelassen. Vorläuferionen mit dem Ladungszustand 3–7 und einer Intensität <5 × 105 waren ebenfalls für die Analyse durch CID/IT vorgesehen, wie oben beschrieben. Vorläuferionen mit Ladungszustand 3–7 und einer Intensität >5 × 105 wurden jedoch im Orbitrap (FT) mit einer Auflösung von 30.000 bei 200 m/z nach hochenergetischer Kollisionsdissoziation (HCD) erfasst. Es wurde eine HCD-Kollisionsenergie von 30 % verwendet, das AGC-Ziel auf 1 × 104 eingestellt und eine Injektionszeit von 40 ms zugelassen. Die Anzahl der MS/MS-Ereignisse zwischen vollständigen Scans wurde spontan bestimmt, um einen festen Arbeitszyklus von 3 s aufrechtzuerhalten. Der dynamische Ausschluss von Ionen innerhalb eines m/z-Fensters von ± 10 ppm wurde mit einer Ausschlussdauer von 35 s implementiert. Es wurde eine Elektrosprühspannung von 2,0 kV und eine Kapillartemperatur von 275 °C ohne Mantel- und Hilfsgasfluss verwendet.

Alle MS/MS-Spektren wurden mit MaxQuant 1.5.1.739 analysiert und anhand einer Datenbank von Bacteroides cellulosilyticus MGS:158 (mit 4369 Einträgen) durchsucht. Proteinsequenzen wurden am 10. Mai 2020 von Uniprot heruntergeladen. Die Peaklistenerstellung erfolgte in MaxQuant und die Suche erfolgte mit Standardparametern und der integrierten Andromeda-Suchmaschine. Die Enzymspezifität wurde so eingestellt, dass vollständig tryptische Peptide berücksichtigt werden, und zwei fehlende Spaltungen waren zulässig. Als variable Modifikationen wurden die Oxidation von Methionin, die N-terminale Acetylierung und die Desamidierung von Asparagin und Glutamin zugelassen. In MaxQuant wurde eine Protein- und Peptid-Falscherkennungsrate von weniger als 1 % verwendet. Proteine ​​wurden sicher identifiziert, wenn sie mindestens zwei einzigartige tryptische Peptide enthielten. Proteine, die ähnliche Peptide enthielten und anhand der MS/MS-Analyse allein nicht unterschieden werden konnten, wurden gruppiert, um den Grundsätzen der Sparsamkeit zu genügen. Rückwärtstreffer und Verunreinigungen wurden vor der nachgelagerten Analyse entfernt. Skyline 4.1.0.11796 wurde zur Extraktion von Ionenchromatogrammen verwendet. Die Anreicherung der Genontologie wurde mit PANTHER42 durchgeführt und die Vorhersage der subzellulären Proteinlokalisierung wurde mit LocateP v243 durchgeführt.

Die mit den in Baccell WH2 [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BaccellWH2_02537 (GH30_3)] und den Proteinen in BT [BT3312 (GH30_3) und BT3314 (GH3)] beschriebenen PULs assoziierten Gene wurden aus Baccell WH2 bzw. BT amplifiziert unter Verwendung ihrer genomischen DNA als Matrize und kloniert in pET28a (Novagen) unter Verwendung von NheI- und Hierzu wurden E. coli TOP10-Zellen (ThermoFisher Scientific) verwendet. Das rekombinante Konstrukt wurde sequenziert (Eurofins Genomics), um seine genetische Integrität zu überprüfen, und dann zur Transformation von E. coli BL21 (DE3)-Expressionszellen (Thermo-Fisher Scientific) verwendet. Die Zellen wurden in Luria-Bertani (LB)-Medium mit 50 mg/ml Kanamycin-Antibiotikum bis zur mittleren logarithmischen Phase (A600 nm von ~0,6) kultiviert. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu den Zellen und anschließendes Wachstum über Nacht bei 16 °C induziert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation (4000 × g) geerntet und im Talon-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8,0 plus 100 mM NaCl) resuspendiert. Resuspendierte Zellen wurden aufgeschlossen und 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert (16.000 × g). Anschließend wurden rekombinante Proteine ​​aus dem resultierenden zellfreien Extrakt durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) unter Verwendung von TalonTM, einer Matrix auf Kobaltbasis, gereinigt. Dabei wurde der zellfreie Extrakt (CFE) auf eine Säule mit Talon-Harz geladen und anschließend mit einem Talon-Puffer gewaschen. Ein weiterer Waschvorgang wurde mit Talon-Puffer, der 10 mM Imidazol enthielt, durchgeführt, gefolgt von der Elution des rekombinanten Proteins mit 100 mM Imidazol. Die gereinigten Proteine ​​wurden dann durch Standarddialyse in einen Puffer Ihrer Wahl ausgetauscht.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Enzymtests in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 150 mM NaCl und in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Tests wurden bei 37 °C unter Verwendung von jeweils 1 µM GH [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BccellWH2_02537 (GH30_3), BcellWH2_02541 (GH2), BT3312 (GH30_3) und BT3314 (GH3)] in Gegenwart von 150 µ durchgeführt M β-Glucan. Über einen Zeitraum von 16 Stunden wurden Aliquote entnommen und Proben und Produkte mittels TLC und Hochdruck-Anionenaustauschchromatographie (HPAEC) mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD) bewertet. Zucker (Mono- und kurze Oligosaccharide) wurden auf einer Carbopac PA1-Schutz- und Analysesäule in einem isokratischen Programm mit 100 mM Natriumhydroxid für 40 Minuten und dann mit einem 100 % linearen Gradienten von 500 mM Natriumacetat über 60 Minuten getrennt. Zucker wurden unter Verwendung der Kohlenhydrat-Standard-Quad-Wellenform für den elektrochemischen Nachweis an einer Gold-Arbeitselektrode mit einer Ag/AgCl-pH-Referenzelektrode nachgewiesen.

Im Fall von GH30_3 und GH157 wurde die Polysaccharidhydrolyse mithilfe eines DNSA-Assays (Dinitrosalicylsäure) mit reduzierendem Zucker quantifiziert48. Die Tests wurden in einem Endvolumen von 1 ml bei optimalem pH-Wert und 37 °C für 10 Minuten durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens (1 ml) DNSA-Reagenz beendet. Die Farbe wurde durch 20-minütiges Erhitzen auf 80 °C entwickelt, bevor A540 abgelesen wurde. Glukose (25 bis 150 µM) wurde verwendet, um eine Standardkurve für die Quantifizierung zu erstellen. Zur Bestimmung der Michaelis-Menten-Parameter wurden unterschiedliche Konzentrationen von Polysaccharidlösungen im Bereich von 0,025 bis 3 mg ml-1 mit der entsprechenden Enzymkonzentration für 10 Minuten verwendet und die Anzahl der freigesetzten reduzierenden Enden wie oben beschrieben quantifiziert. Die Werte wurden mithilfe einer linearen Regression aufgetragen, wobei kcat/Km als Steigung der Linie angegeben wurde.

Im Fall von GH3s und GH2 wurde der enzymatische Assay im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen und die Freisetzung von Glucose mit dem Couple-Assay-Kit von Megazyme (Dublin, Irland) zur Quantifizierung der Glucosefreisetzung gemessen.

Vor der gemeinsamen Kultur wurden Baccell WH2 und BT in einer Gehirn-Herz-Infusion (BHI, Sigma Aldrich, UK) gezüchtet und zweimal in PBS gewaschen. Monokulturen von Bifidobakterienstämmen wurden auf Reinforced Clostridium Media (Oxoid, Basingstoke UK) gezüchtet und in PBS gewaschen, bevor sie zum Beimpfen von Minimal Media (MM) mit 1 % Mykoprotein β-Glucan11 verwendet wurden. Co-Kulturen wurden in angeimpften Minimalmedien mit 1 % Mykoprotein β-Glucan gezüchtet und die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Während des Wachstums wurden in regelmäßigen Abständen Proben von 0,5 ml entnommen, die seriell verdünnt und auf BHI mit Agar und Schweinehämatin zur Bestimmung der Gesamt-KBE pro Milliliter der Kultur (Baccell WH2 und BT) sowie auf verstärktem Clostridium-Medium mit 0,05 % Cystein ausplattiert wurden (für Wildtyp-Bifidobakterienstämme) und mit 100 µg/ml Erythromycin. Lactiplantibacillus plantarum WCSF4 wurde routinemäßig auf MRS-Medium (Melford, UK), ergänzt mit 10 μg/ml Vancomycin, gezüchtet. Jede Monokultur von Bacteroides, Bifidobacterium oder Lactiplantibacillus wurde in bestimmten Abständen während der Kultivierung auch zur Bestimmung der KBE pro Milliliter ausplattiert.

Aus Mono- und Co-Kulturen entnommene Aliquots wurden mittels qPCR analysiert, um das Verhältnis jeder Bakterienart während der Kultivierung zu quantifizieren und das 16 S-rRNA-Gen für jedes Bakterium in der Probe zu amplifizieren. Für diese qPCR haben wir für jedes Bakterium spezifische Primer (1 µM) verwendet, die in Tabelle 2S aufgeführt sind.

Zucker (gemischte Art von Oligosacchariden aus Wachstumsmedien) wurden auf einer Carbopac PA200-Schutz- und Analysesäule in einem isokratischen Programm mit 100 mM Natriumhydroxid für 40 Minuten und dann mit einem 100 % linearen Gradienten von 500 mM Natriumacetat über einen Zeitraum von 60 Minuten getrennt . Zucker wurden unter Verwendung der Kohlenhydrat-Standard-Quad-Wellenform für den elektrochemischen Nachweis an einer Gold-Arbeitselektrode mit einer Ag/AgCl-pH-Referenzelektrode nachgewiesen.

Die 3D-Struktur von GH157 (BcellWH2_01931) wurde mit der Colab-Software AlphaFold2 modelliert. Wir danken dem AlphaFold-Team für die Entwicklung eines hervorragenden Modells und die offene Bereitstellung der Software https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/ main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo=UGUBLzB3C6WN). Das Modell Bccell WH2_02537 (GH30_3) wurde mit Phyre2 Server52 erhalten. Strukturen wurden mit Pymol (The PyMOL Molecular Graphic System, Version 2.0 Schrodinger, LLC) visualisiert.

Zur Beurteilung der SCFA-Produktion durch (Kreuzfütterung) von Baccell WH2 und Bi wurde eine HPLC-Analyse verwendet. Breve UCC2003. Wachstumsmediumüberstände aus der stationären Phase (Co-Kulturen) wurden sterilisiert (0,45 μM Filter, Costart Spin-X-Säule) und in ein UltiMate® BioRS Thermo HPLC-System (Thermo Fisher Scientific) mit einem Brechungsindex-Detektorsystem injiziert. Dieses System wurde verwendet, um die Produktion von Acetat, Laktat und Butyrat als Ergebnis der Kohlenhydratfermentation zu identifizieren und zu berechnen. Die Konzentrationen wurden anhand bekannter Standards berechnet. Als Kontrolle diente nicht fermentiertes Medium mit LW-AG. Es wurde eine Accucore™ C18 HPLC-Säule verwendet und bei 65 °C gehalten. Die Elution erfolgte 25 Minuten lang mit 10 mM H2SO4-Lösung bei einer konstanten Flussrate von 0,6 ml/min.

Die Probe, die die Oligosaccharide enthielt, die aus dem Überstand von auf β-Glucan gewachsenem Baccell WH2 und BT erzeugt wurden, wurde 1:10 (v/v) mit Puffer B (85 % Acetonitril/15 % 50 mM Ammoniumformiat in Wasser, pH 4,7) verdünnt 0,5 μl wurden durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse durch Elution aus einer ZIC-HILIC-Kapillarsäule (SeQuant, 3,5 μm, 200 Å, 150 × 0,3 mm, Merck) analysiert. Die Säule wurde an ein NanoAcquity HPLC-System (Waters) angeschlossen und mit einem Elutionsgradienten wie folgt auf 35 °C erhitzt: 100 % Puffer B für 5 Minuten, gefolgt von einem Gradienten auf 25 % Puffer B/75 % Puffer A (50 mM). Ammoniumformiat in Wasser, pH 4,7) über 40 Min. Die Flussrate betrug 50 μl min−1 und zwischen den Injektionen wurde eine Puffer-B-Äquilibrierung mit 10 Säulenvolumina durchgeführt. MS-Daten wurden mit einem Bruker Impact II QT-Massenspektrometer gesammelt, das im Positivionenmodus, 50–2000 m/z, mit Kapillarspannungs- und Temperatureinstellungen von 2800 V bzw. 200 °C sowie einem Trocknungsgasfluss und Zerstäuberdruck betrieben wurde von 6 l min−1 und 0,4 bar. Die MS-Daten wurden mit der Compass DataAnalysis-Software (Bruker) analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle proteomischen Daten sind im PeptideAtlas hinterlegt (Kennung PASS04831, Rohdaten für Leerwert, Glucose und Mykoprotein β-Glucan als Kohlenstoffquellen). Alle während dieser Studie generierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Alle den Grafiken und Diagrammen zugrunde liegenden Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1. Original-SDS-Gele sind in Abb. S5 verfügbar. Weitere Rohdaten sind auf Anfrage erhältlich.

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JM-M. wird durch ein Doktorandenstipendium unterstützt, das teilweise von Marlow Foods Ltd. finanziert wird. Diese Arbeit wurde unabhängig von Marlow Foods durchgeführt und die Autoren haben kein finanzielles oder sonstiges persönliches Interesse am Ergebnis der Arbeit. JM-M. erhielt finanzielle Unterstützung durch ein internes Stipendium der Northumbria University. Dv-S. ist Mitglied der APC Microbiome Ireland, die im Rahmen des Nationalen Entwicklungsplans der irischen Regierung finanzielle Unterstützung von der Science Foundation Ireland (SFI/12/RC/2273 − P1 und SFI/12/RC/2273 − P2) erhält.

Labor für mikrobielle Enzymologie, Fachbereich Angewandte Wissenschaften, Northumbria University, Newcastle Upon Tyne, NE1 8ST, Tyne & Wear, England, Vereinigtes Königreich

Pedro Fernandez-Julia, Gary W. Black, William Cheung und Jose Munoz-Munoz

School of Microbiology & APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Irland

Douwe Van Sinderen

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PF-J. geklonte, exprimierte und gereinigte rekombinante Enzyme; Durchführung und Analyse der Kinetik für die Hydrolyse von Polysacchariden, Oligosacchariden und chromogenen Substraten; bestimmte Hydrolyseprodukte in der HPLC; führte Wachstumskurven aller anaeroben Bakterien durch; führte Kreuzfütterungsexperimente durch; und habe den Artikel geschrieben. WC führte und analysierte die Proteomikdaten und verfasste den Proteomikabschnitt im Manuskript. GB, DVS und JM-M. entwarf und leitete die Recherche und war Co-Autor des Artikels mit Beiträgen aller Autoren.

Korrespondenz mit Jose Munoz-Munoz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Tobias Goris. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fernandez-Julia, P., Black, GW, Cheung, W. et al. Durch pilzliches β-Glucan erleichterte Kreuzfütterungsaktivitäten zwischen Bacteroides- und Bifidobacterium-Arten. Commun Biol 6, 576 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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Eingegangen: 19. Dezember 2022

Angenommen: 23. Mai 2023

Veröffentlicht: 30. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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